氧化应激对磷酸三钙磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解的影响及其机制*

刘坚荣, 毛红娇, 郭高力, 傅晶蕾, 童 夏, 钱沁清, 骆华刚, 张 云

(绍兴文理学院医学院基础医学部， 浙江 绍兴 312000)

人工关节置换术是治疗终末期关节疾患、重建关节功能的重要手段。然而，随着关节置换病例的增加和时间的延长，假体晚期松动问题日益突出。大量研究表明，聚乙烯(polyethylene，PE)、钛(titanium，Ti)和磷酸三钙(tricalcium phosphate，TCP)等关节假体经过长期磨损产生的大量的磨损颗粒聚集于假体表面，刺激假体周围单核细胞、成骨细胞和成纤维细胞等组织细胞释放肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、白介素1β(interleukin-1beta，IL-1β)、白介素6(interleukin-6，IL-6)和前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)等炎症因子[1-2]，引起体内一系列持续性炎症反应，使得局部破骨细胞生成增加，最终造成假体周围炎症性骨溶解和关节松动[2-5]。因此，磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解是引起关节松动和翻修的主要原因之一。

最近有研究显示，松动假体周围组织中氧化应激产物谷胱甘肽(glutathione, GSH)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)和活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量显著增加[6-8]，提示氧化应激可能在磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解中发挥重要作用，但具体机制尚不明确。本研究应用TCP磨损颗粒构建小鼠假体周围骨溶解模型，同时引入抗氧化剂N-乙酰L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)，探讨氧化应激在TCP磨损颗粒诱导假体周围骨溶解中的作用，并阐明其可能作用机制，为防治假体周围骨溶解和关节松动提供新的治疗靶标和实验基础。

1 材料与方法

1.1 动物分组与模型建立

SPF级雄性ICR小鼠购于浙江省医学科学院实验动物中心(SCXK(浙)2014-0001)。实验前动物适应性饲养1周，环境温度(22～24)℃、相对湿度(50～70) %，动物自由进食、进水，自然昼夜节律光照。取36只6周龄雄性ICR小鼠，随机分为假手术(Sham)组、TCP磨损颗粒(TCP)组和N-乙酰L-半胱氨酸(NAC)组，每组12只。腹腔注射1.5%戊巴比妥钠麻醉小鼠后，无菌条件下取颅顶正中矢状切口，长约0.8 cm。分离皮下组织，显露出1 cm×1 cm颅骨区域。其中Sham组行原位缝合，其余两组取TCP磨损颗粒(30 mg)置于颅顶处后缝合皮肤。NAC组小鼠于术后第2天于颅顶骨膜部位注射NAC(1.0 mg/kg)，隔日注射1次，持续2周。实验结束后，各组小鼠眼眶后静脉丛取血；同时取出颅骨(以正中矢状缝为中心的方形区域)，PBS清洗，用滤纸吸去多余水分后用分析天平称量颅骨湿重(mg)。

1.2 药品与试剂

TCP磨损颗粒由浙江大学化学系馈赠。鲎试剂购自上海吴昊经贸有限公司。TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA试剂盒，ECL化学发光检测试剂盒购自杭州联科生物技术有限公司。T-AOC试剂盒、SOD试剂盒、RIPA裂解液和NAC购自碧云天生物试剂有限公司。多聚甲醛和EDTA购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。兔抗GRP78抗体、兔抗PERK抗体、兔抗p-PERK抗体、兔抗eIF2α抗体、兔抗p-eIF2α抗体和小鼠抗β-actin抗体购自Cell Signaling公司。PVDF膜购自Millipore公司。

1.3 采血并制备血清

实验结束后，各组小鼠分别于眼眶后静脉丛采血1.0 ml置于EP管中，待血液凝固后于4 ℃、3000 r/min离心10 min，分离血清。

1.4 TRAP染色观察假体周围骨溶解

各组小鼠的颅骨经4%多聚甲醛液固定10 min，0.25 mol/L氢氧化铵超声清洗5 min。然后置于系列乙醇(50%，80%，90%，100%)中梯度脱水，自然晾干后加入TRAP染色液中室温避光染色60 min。蒸馏水清洗后，置IX70显微镜下观察TCP磨损颗粒植入部位周围的骨溶解情况。

1.5 化学比色法检测血清T-AOC含量和SOD活性[9]

分别采用T-AOC和SOD试剂盒检测小鼠血清中T-AOC含量和SOD活性。

1.6 ELISA法检测血清TNF-α、IL-1β和IL-6的水平

取96孔板，每孔加入50 μl血清，分别按照TNF-α、IL-1β和IL-6ELISA检测试剂盒说明书，测定血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量。

1.7 Western blot法检测蛋白质表达[10]

每组取等质量假体周围颅骨组织置于研钵内，在液氮环境下研磨成粉末，然后转移至EP管中。加入RIPA裂解液800 μl裂解30 min，于4℃、12 000 r/min离心15 min，收集上清液。采用BCA法检测各组总蛋白质浓度。加入上样缓冲液后煮沸10 min，冷却后每孔上样30 μg蛋白质，进行SDS-PAGE后转至PVDF膜上。经5%脱脂牛奶常温孵育2 h后，用兔抗GRP78(1∶1 000稀释)、兔抗PERK(1∶1 000稀释)、兔抗p-PERK(1∶1 000稀释)、兔抗eIF2α(1∶1 000稀释)、兔抗p-eIF2α(1∶1 000稀释)及鼠抗β-actin(1∶1 000稀释)等单克隆抗体于4℃孵育过夜。次日用TBST洗涤3次，加入HRP标记的二抗室温孵育2 h，TBST清洗3次后加入ECL显色液。通过凝胶成像系统扫描分析各蛋白质含量的变化。每个样品重复检测3次。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 各组小鼠血清炎性因子水平的比较

与Sham组比较，TCP组小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显增高，分别为Sham组的1.24倍、3.54倍和1.44倍(P<0.05)；与TCP组比较，NAC组小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显减低，分别减少18.2%、42.5%和32.5%(P<0.05，表1)，表明NAC可抑制TCP磨损颗粒诱导的炎性因子释放。

GroupsTNF-αIL-1βIL-6Sham65.41±2.732.42±2.543.65±1.3TCP80.81±3.1*114.86±6.6*63.02±2.1*NAC66.13±1.9#66.05±2.9#42.53±3.4#

TNF-α: Tumor necrosis factor-alpha; IL-1β: Interleukin-1beta; IL-6: Interleukin-6; TCP: Tricalcium phosphate; NAC: N-acetyl-L-cysteine

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsTCP group

2.2 各组小鼠假体周围骨溶解水平的比较

TRAP染色结果显示：与Sham组比较，TCP组小鼠颅骨正中矢状缝发生明显大面积骨溶解、颅骨湿重明显减少，其骨溶解面积和颅骨湿重分别是假手术组的2.64倍和62.6%(P<0.05)；与TCP组比较，NAC组小鼠颅骨假体周围骨溶解面积减少58.5%，而颅骨湿重增加29.0%(图1，P<0.05)。提示NAC能阻止TCP磨损颗粒诱导的小鼠假体周围骨溶解。

2.3 各组小鼠血清氧化应激相关指标水平的比较

与Sham组比较，TCP组小鼠血清中T-AOC含量和SOD活性明显降低，分别减少54.5%和42.2%(P<0.05)；与TCP组比较，NAC小鼠血清T-AOC含量和SOD活性明显升高，分别是TCP组的2.21倍和1.34倍(P<0.05，图2)，提示NAC可抑制TCP磨损颗粒诱导的氧化应激反应。

2.4 各组小鼠假体周围骨组织PERK/eIF2α信号通路活化

与Sham组比较，TCP组假体周围发生内质网应激反应，PERK/eIF2α信号通路被激活，表现为TCP组小鼠颅骨组织中内质网应激通路蛋白质GRP78、p-PERK和p-eIF2α水平均明显增加(P<0.05)，p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α值明显升高。与TCP组比较，NAC组小鼠颅骨组织中GRP78蛋白质表达、p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α值明显降低(P<0.05，图3)，表明NAC可抑制TCP磨损颗粒诱导的假体周围骨组织内质网应激反应及PERK/eIF2α通路的活化。

Fig.1Periprosthetic osteolysis induced by TCP wear particles in the mouse calvaria (n=12)

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsTCP group

A: T-AOC level; B: SOD activity. T-AOC: Total antioxidation capacity; SOD: Superoxide dismutase; TCP: Tricalcium phosphate; NAC: N-acetyl-L-cysteine

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsTCP group

Fig.3The protein expression of ER stress pathway in the mice calvaria (n=12)

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsTCP group

3 讨论

氧化应激是指机体自由基、ROS产生过多或机体抗氧化能力减弱，ROS清除不足，体内ROS蓄积超出了机体的清除能力，导致氧化/抗氧化失衡而造成细胞和组织氧化损伤的病理过程。有研究表明，松动假体周围组织中ROS水平较高，大量的ROS攻击假体周围组织细胞后引起GSH和MDA含量增加，改变细胞膜通透性进而诱导氧化应激反应和假体周围骨溶解[6-8]。与之类似，本研究结果显示，TCP组小鼠血清T-AOC含量和SOD活性明显下降，抗氧化剂NAC能明显减轻TCP磨损颗粒诱导的炎性因子的释放和假体周围骨溶解，与Fang等[11]报道的NAC阻止PE颗粒诱导的小鼠颅骨溶解的结果一致。以上研究结果提示，氧化应激参与调控磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解。既往研究表明，氧化应激能通过耗竭抗氧化物质而引发内质网应激，间接促进破骨细胞分化、存活而影响骨吸收[12-15]。本研究中TCP磨损颗粒诱导的氧化应激是否与内质网应激通路的激活有关，目前尚不清楚。

内质网是细胞内负责蛋白质合成、翻译后修饰和折叠组装的重要细胞器。内质网应激状态是指缺氧、饥饿、钙平衡紊乱、自由基侵袭及药物等刺激诱导的细胞内未折叠蛋白质堆积，内质网稳态被打破的病理性应激状态。内质网应激的调控包含PERK/eIF2α、1型内质网转膜蛋白激酶α(inositol-requiring enzyme1α，IRE1α)和活化转录因子6(activating transcription factor 6，ATF6)三条信号通路[16,17]。其中，PERK是内质网膜上的感应蛋白，在内质网应激状态下，PERK与内质网应激分子伴侣GRP78解离并发生自身磷酸化，磷酸化的PERK使其下游eIF2α磷酸化而抑制蛋白质合成，恢复内质网功能而促进细胞存活[16]。因此，常以p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α比值的变化反映PERK/eIF2α通路的活化情况。近年来，Wang等[18]和Liu等[19]报道，CoCrMo和TiAl6V4等磨损颗粒能激活IRE1α和ATF6内质网应激通路，本实验结果表明TCP磨损颗粒可激活假体周围骨组织中PERK/eIF2α信号通路介导的内质网应激反应，上调内质网应激通路蛋白质GRP78表达、增加p-PERK/PERK和p-eIF2α/p-eIF2α比值(图3)，与我们之前的报道一致[5]。这提示：在假体周围骨溶解过程中磨损颗粒能激活内质网应激的三条经典信号通路，其应答差异可能是由于磨损颗粒种类不同所致。

另外，黄建青等[20]研究显示，NAC能抑制晚期糖化终产物诱导的成骨样细胞MG63中GRP78表达增加，减弱内质网应激所致的IL-6释放而阻止骨溶解。本研究观察到NAC能明显减轻TCP磨损颗粒诱导的内质网应激标志蛋白质GRP78上调及PERK/eIF2α通路活化，表明TCP磨损颗粒可能通过诱导氧化应激，引起内质网应激及PERK/eIF2α通路活化，最终造成内质网应激通路介导的假体周围骨溶解。氧化应激是否影响IRE1α和ATF6通路而调节TCP磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解，尚需深入探讨。