OTX2基因表达下调对MC3T3-E1细胞增殖分化和自噬的影响

田玉楼，于默，史娅婕，张薇

（中国医科大学口腔医学院正畸教研室，沈阳 110002）

骨性反牙合是临床中常见的错牙合畸形，下颌骨发育过度是其主要发病机制，目前虽尚未有明确的易感基因，但口腔颌面发育相关基因表达水平的变化会影响其发生。OTX2属于邻位齿状同源盒 （orthodentielehomeo-box，OTX） 基因家族的一员，在颅面和脑前结构的生长发育中起关键作用，参与第一鳃弓和第二鳃弓的形成。OTX基因家族是骨性反牙合的候选基因，参与调控下颌骨的生长发育［1］。OTX2基因的缺失可能引起口腔、下颌骨、脊椎等的发育缺陷，引发眼-耳-脊椎综合征［2］。

自噬是一种广泛存在于真核细胞中的高度保守的过程，是骨形成和发育过程中不可缺少的调节因子［3-4］。自噬可增强颅颌面骨骨髓间充质干细胞的增殖和抗凋亡能力，调控其向成骨细胞分化［5-6］，还可以帮助处于应激条件下的成骨细胞抵御环境变化，维持其增殖和正常生理功能［7］。通过抑制成骨细胞自噬水平可以抑制该细胞增殖［8］，提示自噬与成骨细胞的形成和细胞增殖有密切关系，降低成骨细胞的自噬水平可以引起成骨细胞的增殖减少。

本研究应用小干扰RNA （small inteference RNA，siRNA）技术下调小鼠成骨细胞系MC3T3-E1中OTX2的表达水平，检测其对成骨细胞增殖、分化的影响，观察自噬水平的改变，为阐明骨性反牙合的分子遗传机制奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

α MEM培养基 （美国Hyclone公司） ，胎牛血清 （美国CLARK公司） ，抗OTX2抗体 （英国Abcam公司） ，siRNA-mate转染试剂和化学合成的OTX2-siRNA （苏州吉玛公司） ，SABC试剂盒及DAB显色试剂 （武汉博士德公司） ，碱性磷酸酶 （alkaline phosphatase，ALP） 测试盒 （南京建成生物工程研究所） ，MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒、AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、自噬染色检测试剂盒 （MDC法） 均购自江苏凯基生物技术股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染：小鼠成骨细胞系MC3T3-E1购自中科院细胞库，在含10%胎牛血清、1%双抗 的α MEM中 于37 ℃、5%CO2培 养 箱 中 培 养。3～4 d传代1 次，当细胞生长为对数期时进行实验。设计3对靶向的OTX2-siRNA序列，用于转染MC3T3-E1细胞系。OTX2-siRNA合成序列如下，OTX2-mus-868，5’-GCAGUGCUCCAGUGUCUAU TT-3’，5’-AUAGACACUGGAGCACUGCTT-3’；OTX2-mus-1027，5’-GCAUGGACUGUGGAUCUUAT T-3’，5’-UAAGAUCCACAGUCCAUGCTT-3’；OTX2-mus-1225，5’-CCUCUUGGAAGCUUAACUUTT-3’，5’-AAGUUAAGCUUCCAAGAGGTT-3’；阴 性 对 照siRNA，5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。 将MC3T3-E1细胞随机分为OTX2-mus-868组、OTX2-mus-1027组、OTX2-mus-1225组、阴性对照组及空白对照组。将MC3T3-E1接种在无菌6孔板中（2×105/孔），待细胞融合达80%左右，参照siRNA-mate说明书进行转染，48 h收集细胞。

1.2.2 免疫细胞化学法检测各组细胞OTX2蛋白表达：消化MC3T3-E1，并调整细胞浓度至1×106/mL，分别取100 μ L单细胞悬液滴加在预先放置无菌盖玻片的6孔板内，细胞培养24 h后转染。转染48 h后，取出细胞爬片，冷丙酮固定30 min，用30%过氧化氢+纯甲醇混合液浸泡35 min，PBS冲洗，再用5%BSA封闭30 min，滴加1∶400稀释的一抗，4 ℃反应16 h，PBS冲洗，再滴加二抗37 ℃孵育20 min，PBS冲洗，SABC试剂继续孵育20 min，最后用加入含0.015%Tween20的PBS洗涤切片，DAB显色3 min，封片，观察。20倍物镜下，随机选取5个视野，计数100个细胞中的阳性细胞数，计算各组阳性细胞所占百分比，并进行统计分析。选取免疫细胞化学检测后干扰效果最好的一组OTX2-siRNA进行后续实验。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖：消化转染后细胞，以2×104/mL浓度接种于96孔板，每孔200 μ L混匀。设立不含细胞的空白组，共4组，每组设4个平行孔。转染48 h后，每孔中加入1×MTT 50 μ L，置培养箱中继续培养4 h，吸出上清液，加入DMSO150 μ L，平板摇床摇匀5 min，使其充分溶解，利用酶标仪在550 nm处读取光密度 （optical density，OD） 值。计算比较各组细胞抑制率［细胞抑制率（%） =1- （OD实验组-OD空白组） /（OD对照组-OD空白组） ×100］。

1.2.4 流式细胞术检测细胞周期：无EDTA的胰酶消化转染后48 h细胞，取1 mL单细胞悬液 （浓度为1×106/mL） ，离心去上清，70%冷乙醇4 ℃过夜，冲洗离心后加入100 μ L RNase A，37 ℃水浴30 min，加入400 μ L 碘化丙啶 （propidium iodide，PI） 避光染色，4 ℃静置30 min，上机检测，激发波长488 nm处红色荧光，计算各组细胞S期细胞比例和增殖指数。

1.2.5 AnnexinV-EGFP/PI双标记法检测细胞凋亡：转染48 h细胞消化后，2 000 r/min离心5 min收集，用预冷PBS洗涤细胞2次，离心收集细胞，加入500 μ L Binding Buffer重新悬浮细胞，再依次加入5 μ L AnnexinV-EGFP混匀，5 μ L PI混匀，室温避光反应15 min，流式细胞仪检测。

1.2.6 化学比色法检测ALP合成情况：吸取转染后48 h的细胞培养液，2 500 r/min离心10 min，取上清液进行测定。按照ALP检测试剂盒说明配制反应液，分别设空白孔、标准孔和测定孔，充分混匀并置于37 ℃水浴15 min，轻轻振摇孔板混匀，于波长520 nm，酶标仪检测各孔OD值。培养液中ALP活力（金氏单位/100 mL） =［ （测定OD值-空白OD值） / （标准OD值-空白OD值） ］×酚标准品浓度 （0.1 mg/mL） ×100 mL×样品测定前稀释倍数。

1.2.7 MDC检测细胞自噬水平：细胞爬片转染48 h后，弃掉原培养基，加入300 μ L 1×wash buffer洗涤，每孔加入100 μ L配置好的MDC染色工作液，室温避光染色20 min。300 μ L 1×wash buffer清洗3次，滴加100 μ L collection buffer，加盖玻片。荧光显微镜下用紫外光激发，观察、拍照。高倍镜 （×40） 下计数100个细胞，计算绿色荧光细胞占细胞总数的百分比。

1.3 统计学分析

实验数据用表示，采用SPSS 21.0统计软件对多组间参数进行单因素方差分析，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组转染细胞OTX2蛋白表达情况

与阴性对照组和空白对照组相比，3个OTX2-siRNA转染组细胞染色明显变浅，OTX2蛋白表达水平下调。阳性细胞百分率计数结果显示，OTX2-mus-868组为（37.0±2.0） %、 OTX2-mus-1027组为（49.2±1.9） %、OTX2-mus-1225组为（45.0±1.6） %，阴性对照组为（96.4±2.0） %、空白对照组为（96.6±1.1） %，3个OTX2转染组与阴性对照组之间阳性细胞百分比的差异有统计学意义 （P＜ 0.05） ，其中OTX2-mus-868组表达水平最低，故后续实验选用OTX2-mus-868转染细胞作为实验组；阴性对照组与空白对照组之间差异无统计学意义 （P＞ 0.05） ，见图1～2。

2.2 OTX2抑制对MC3T3-E1细胞增殖活性的影响

图1 转染48 h后各组细胞OTX2免疫细胞化学染色结果 ×200Fig.1 Immunocytochemical staining results of OTX2 in each group after 48 h of transfection ×200

图2 转染48 h后各组细胞OTX2阳性细胞百分率Fig.2 Percentage of OTX2 positive cells in each group after 48 h of transfection

MTT结果显示，实验组、阴性对照组、空白对照组OD值分别为0.28±0.02，0.34±0.04，0.34±0.03。实验组细胞增殖抑制率为 （47.04±7.02） %，与阴性对照组比较差异有统计学意义 （P＜ 0.05） ，而阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义 （P＞ 0.05） ，见表1。

2.3 OTX2抑制对MC3T3-E1细胞周期的影响

流式细胞术分析结果显示，转染OTX2-siRNA后S期细胞比率和增殖指数明显减小，与阴性对照组相比，差异有统计学意义 （P＜ 0.05） ，而阴性对照组和空白对照组比较差异无统计学意义 （P＞ 0.05） 。见表2。

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡结果

转染48 h后，AnnexinV-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡，实验组、阴性对照组和空白对照组总凋亡率差异比较无统计学意义 （P＞ 0.05） ，见图3、表3。

表1 转染后各组细胞OD值和增殖抑制率Tab.1 OD value and proliferation inhibition rate of each group after transfection

表2 转染后各组细胞S期比例及增殖指数Tab.2 S phase ratio and proliferation index of cells in each group after transfection

图3 转染48 h后MC3T3-E1细胞凋亡情况Fig.3 Apoptosis of MC3T3-E1 cells transfected for 48 h

表3 转染后各组细胞的总凋亡率和早期凋亡率 （%）Tab.3 Total apoptotic rate and early apoptotic rate of cells in each group after transfection （%）

2.5 OTX2抑制对细胞ALP合成的影响

与空白对照组及阴性对照组比较，实验组细胞ALP活性明显下降 （P＜ 0.05） ；而空白对照组和阴性对照组相比，则无明显变化 （P＞ 0.05） ，表明OTX2表达下调后MC3T3-E1细胞的分化能力明显减弱。见表4、图4。

2.6 转染后成骨细胞自噬水平改变

MDC荧光染色可以观察细胞的自噬水平。如图5所示，实验组MDC染色荧光强度低，点状结构少，阴性对照组和空白对照组染色强度高，点状结构多。实验组荧光细胞百分比为（3.11±0.07） %，阴性对照组为（9.36±1.25） %，空白对照组为（10.54±2.89） %。实验组荧光细胞比例低于阴性对照组，差异有统计学意义 （P＜ 0.05） 。

表4 转染后各组细胞上清液OD值及ALP活力值Tab.4 OD value and ALP activity value of supernatant in each group after transfection

图4 转染48 h后MC3T3-E1细胞ALP合成情况Fig.4 ALP synthesis of MC3T3-E1 cells after transfection for 48 h

3 讨论

自噬是一种溶酶体介导的降解途径，在基础条件和压力条件下降解细胞内的长寿蛋白质或受损伤细胞器，使其成为细胞所需的三磷酸腺苷和营养物质，用来维持细胞内的稳态［9-10］。目前，研究证实自噬对于骨细胞、成骨细胞、破骨细胞的形成和分化起着不可缺少的调节作用。在氟或铅的应激环境下，可以引起小鼠成骨细胞MC3T3-E1的凋亡增加，增殖减少，并诱导其发生自噬，而发生自噬后的成骨细胞，增殖能力反而增强［11-12］，表明自噬可作为一种保护机制，减轻外界环境对成骨细胞的损伤，减少成骨细胞凋亡。

图5 MDC荧光染色转染后的MC3T3-E1细胞 ×400Fig.5 MDC fluorescent staining of MC3T3-E1 cells after transfection ×400

OTX2基因最早出现在胚胎形成初期的内胚层和外胚层，在间脑、中脑等区域中有表达，对于眼、颌骨及神经系统的发育具有重要作用［13］。敲除OTX2基因的纯合子小鼠胚胎致死率明显升高且出现无下颌畸形，小鼠的第三菱脑结构不能正常发育，说明OTX2在颅脑前部的发育中具有重要作用［14-15］，而中脑和菱脑的形成与颅颌面骨的发育密切相关。OTX2在下颌骨远中区域和下颌骨前部发育的中脑神经嵴细胞中有表达［16-17］，提示OTX2对于颌骨的发育可能起重要作用。本研究通过下调MC3T3-E1中OTX2基因的表达，研究其对成骨细胞的增殖以及自噬的影响，为研究下颌骨过度发育的机制奠定基础。

本研究结果表明，OTX2-siRNA能下调MC3T3-E1细胞中OTX2基因的表达，抑制MC3T3-E1增殖，而对其凋亡水平无明显影响。ALP是骨形成的特异性酶，具有促进骨矿化的能力，常常通过其活性高低来表示成骨细胞的分化水平［18］。本研究结果显示，转染后成骨细胞上清液OD值明显减小，ALP活力单位降低，表明OTX2基因表达下调可以明显降低MC3T3-E1细胞的分化水平。MDC是一种嗜酸性染液，可以选择性地结合到细胞内自噬小体的囊泡膜上，是一种用来检测自噬水平的荧光染色剂。本研究中，MDC染色结果显示，转染后的MC3T3-E1细胞染色强度弱，点状结构少，提示OTX2基因表达下调后，MC3T3-E1自噬水平降低。本研究组将进一步通过体外实验建立OTX2差异表达的成骨细胞模型，通过诱导和抑制细胞自噬水平来观察其对细胞增殖、分化、凋亡等生物学性征的影响，探讨可能存在的信号调控通路。