基于线粒体COⅠ基因序列进行库蠓亚属(双翅目：蠓科)近似种的分子鉴定*

岑常活 徐宗意 韩晓静 常琼琼 段 琛 侯晓晖

(遵义医学院，贵州遵义 563000)

库蠓属(CulicoidesLatreille, 1809)是我国蠓科三大吸血蠓属之一，该属昆虫个体微小、种类繁多，广泛分布于世界各地。迄今为止，全世界吸血蠓已知4属1 671种，我国已知3属443种(Borkent, 2016; 常琼琼等, 2017)。吸血蠓不仅可刺吸血液、叮咬人畜，还可作为媒介传播多种病毒，如蓝舌病病毒(BTV)、施马伦贝格病毒(SBV)、家畜流行性出血热病毒(EHDV)、非洲马瘟病毒(AHSV)等(Purse, 2015)，这些病毒可引发家畜流行病造成巨大的经济损失，如欧洲BT和SB大流行等(Saegermanetal., 2008;Hoffmannetal., 2012)。另外，蓝舌病(BT)和非洲马瘟病(AHS)已被列入世界动物卫生组织(OIE)优先考虑的15种疾病之中(Perrinetal., 2006)。

蠓科昆虫的传统形态学鉴定方法往往依赖形态结构完整的成虫，性别差异、非成虫阶段以及形态残缺虫体的鉴定往往也比较困难，有时甚至无法鉴定。同时，库蠓形态变异较大，近似种的鉴定往往十分困难。例如，库蠓亚属中的刺螫库蠓C.punctatus、灰黑库蠓C.pulicaris和新替库蠓C.newsteadi以及它们中还存在诸多由形态特征相似的隐种组成的复组或种团(灰黑库蠓种团和新替库蠓种团)(Pagesetal., 2009)等，这无疑使其近缘、近似种的鉴别变得更为艰难。线粒体DNA一般为不含间隔区和内含子的双链环状，且作为核外遗传信息载体，具有结构简单、无重复序列、母系遗传、进化速度快等特点，是研究昆虫群体分子分类、遗传结构、分子系统发育的理想分子标记(Liuetal., 2013)，且已应用于多种昆虫类群的分子鉴定研究(贺骥等，2014；胡泽章等，2017；陈珊等，2017)，极大地弥补了传统形态分类学鉴定的不足。虽然蠓科昆虫的分子分类研究起步较迟，但进展迅速。自1992年变翅库蠓Culicoidesvariipennis种群的基因差异研究开始(Tabachnick, 1992)，国际上有关蠓科昆虫的分子生物学研究突飞猛进(Augotetal., 2010; Anderetal., 2013; Denisetal., 2013; Sturetal., 2014)，为开展蠓科昆虫的分子分类技术研究奠定了坚实基础。相比之下，国内有关蠓科昆虫的分子分类学研究却鲜有报道。因此，本研究以库蠓亚属中刺螫库蠓C.punctatus、灰黑库蠓C.pulicaris和新替库蠓C.newsteadi3个形态近似种为例，分析COⅠ分子分类方法应用于鉴别不同生境的库蠓近似种的可行性，为蠓虫分类及其相关研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 蠓虫标本及采集

于2014—2016年赴贵州、广西、四川、重庆、黑龙江等5省市进行蠓虫采集，并置于无水乙醇中，-20 ℃保存备用。本研究选择4种、50个库蠓的COⅠ分子数据，其中荒川库蠓C.arakawai和刺螫库蠓C.punctatus数据来自研究组采集的标本，而灰黑库蠓C.pulicaris和新替库蠓C.newsteadi数据来自于GenBank数据库，具体信息见表1。

表1 供试库蠓的相关信息

续表1 Tab.l Continued

1.2 主要仪器和试剂

光学体式显微镜(德国Leica公司)、PCR扩增仪(美国BOI-RAD公司)、UVP凝胶成像系统(美国BOI-RAD公司)等。基因组提取试剂盒(QIAGEN, 德国)、PCR MasterMix(TIANGEN, 中国)、引物(上海捷瑞生物工程有限公司)、琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN, 中国)、琼脂糖(Biowest Agarose, 西班牙)等。

1.3 标本鉴定

按照常规方法对蠓虫标本进行分选、解剖，除胸部外制成永久装片用于形态鉴定，胸部样本单独编号后进行分子实验。根据虞以新(2005)对本研究的库蠓进行种类鉴定，并进行一侧翅的拍照。

1.4 基因组DNA提取

将保存的蠓虫胸部研磨后，按照QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit说明书进行单只蠓虫基因组DNA提取，并保存至-20 ℃。

1.5 PCR扩增

按照通用引物(上游引物LCO1490：5′- T A A A C T T C A G G G T G A C C A A A A A A T CA -3′和下游引物HCO2198：5′- G G T C A A C A A A T C A T A A A G A T A T T GG -3′)进行COⅠ序列的扩增(Folmeretal., 1994)，引物终浓度为10 pmol/μL，模板DNA为1.5 μL，反应总体系为25 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环35次；72 ℃延伸5 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带判断是否为目的条带。按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行PCR产物切胶纯化，纯化后的产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行双向测序。

1.6 COⅠ序列分析

利用Clustal X、DNAMAN、MEGA 6.0、Mrbayes v3.1.2、Modeltest v3.7等生物信息学软件对库蠓线粒体DNA COⅠ序列进行比对、编辑、比较等分析，以Kimura双参数模型计算遗传距离矩阵。以荒川库蠓C.arakawai为外群，通过邻接法(NJ)、最大似然法(ML)和贝叶斯法(Bayes)构建分子系统树。根据Bootstrap 1 000次自举检验确定NJ和ML系统树中各结点的置信值。采用Mrbayes v3.1.2构建Bayes树，通过Modeltest v3.7估算的最优模型为 TVM+G，具体的替换模型参数设置为核苷酸替换类型数=6(nst=6)；设置位点间速率变异呈gamma分布(rates=invgamma)；对MCMC变量运行4条马尔科夫链，以随机树为起始树，共运行1百万代(ngen=1000000)，每1000代进行一次抽样(samplefreq=1000)；在去掉老化样本后，应用剩余的样本构建系统树，将所得结果进行统计，得到Bayes树的支系结构以及各支系的后验概率。

1.7 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差表示。两两比较采用两独立样本t检验，P﹤0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 形态学特征比较

刺螫库蠓C.punctatus、灰黑库蠓C.pulicaris和新替库蠓C.newsteadi等3种近似种的形态特征十分相近。在3种雌性库蠓形态特征中，除胸部特征外，头部和腹部的6个形态特征基本一致(表2)；在胸部翅斑分布的8个形态特征中，除第1前缘暗斑是否延伸超过中2室的1/2、翅臀室淡斑数目以及中1室和中2室的暗斑是否相互连接等极细微的差异外几乎无异(图1)。同时，在3种雄性库蠓的尾器部分，存在第9腹板后缘凹陷、阳茎中叶呈柱状和抱器基节粗壮、内侧缘有一簇刺状鬃和阳基侧突基部分离、中部稍长、端部细分枝等多处相似之处(表2中未列出)。因此，由于这些极其相似的形态学特征使得上述种类在进行形态学分类时变得异常艰难。

图1 本研究中库蠓近似种的左侧翅图Fig.1 The left wing of sibling species in this study1. 刺螫库蠓C. punctatus；2. 灰黑库蠓C. pulicaris；3. 新替库蠓C. newsteadi.

2.2 PCR扩增及序列测定

本研究通过对4种、18个地理种群的50只库蠓线粒体COⅠ基因序列进行PCR扩增、纯化和双向测序，并经过序列比对及人工校对后，最终获得长度约394 bp的COⅠ基因片段。

2.3 序列比对

将本研究中获得的全部荒川库蠓C.arakawai和刺螫库蠓C.punctatus的COⅠ序列与GenBank数据库中同源序列进行比对，搜索到的同源序列登录号分别为AB360975.1(荒川库蠓C.arakawai)和AB360989.1(刺螫库蠓C.punctatus)的同源序列，前者与荒川库蠓(GX-2/SC-1/SC-2/GZ-2)的序列相似度均大于99%，与荒川库蠓(CQ-1/GZ-1/GX-1)的序列相似度为100%；后者与刺螫库蠓C.punctatus的序列相似度均大于98%。

2.4 遗传距离

利用MEGA 6.0软件计算库蠓COⅠ序列的遗传距离(详见附表一)。结果表明，种内和种间遗传距离分别为0.000～0.014和0.181～0.234，两者差异显著。同时，通过采用两独立样本t检验统计分析，种内组为0.007±0.007，种间组为0.202±0.019，统计结果为P﹤0.05，故两者差异具有统计学意义。因此，通过COⅠ序列遗传距离分析可以区分刺螫库蠓C.punctatus、灰黑库蠓C.pulicaris、新替库蠓C.newsteadi等库蠓近似种，提示COⅠ序列可用于库蠓的种类鉴别。

2.5 系统发育分析

本研究选择与刺螫库蠓C.punctatus等3个近似种处于不同亚属(二囊亚属)的荒川库蠓C.arakawai为外群，采用邻接法(NJ)、最大似然法(ML)和贝叶斯法(Bayes)分别构建4种库蠓的系统发育树，得到基本一致的拓扑结构(图2～3)。系统发育树聚类分析表明：在NJ树、ML树和 Bayes树中，荒川库蠓C.arakawai、刺螫库蠓C.punctatus、灰黑库蠓C.pulicaris和新替库蠓C.newsteadi等4种不同库蠓各自构成单系(群)，同一种不同地理种群各自聚为一支，且4种不同库蠓种类间无交叉，与形态学鉴定结果一致。由图2可以看出，灰黑库蠓C.pulicaris和新替库蠓C.newsteadi首先聚合在一起形成一支，继而与同为库蠓亚属的刺螫库蠓C.punctatus聚类为一大支，最后与以荒川库蠓C.arakawai为外群的二囊亚属汇合，形成完整的有根树。

图2 基于线粒体COⅠ序列构建的ML树Fig.2 Maximum Likelihood tree constructed based on mitochondrial COⅠ sequence注：各分支上的数字为自举检验置信值1000次。Note: Numbers on each node are the values of bootstrap 1000 replicates.

图3 基于线粒体COⅠ序列构建的Bayes树Fig.3 The Bayes tree constructed based on mitochondrial COⅠ sequence注:各分支上数字为后验概率。Note: Numbers on each node are posterior probability value.

3 讨论

从Hebert等提出COⅠ基因是DNA条形码标准基因以来(Hebertetal., 2003)，COⅠ基因在蠓虫的分子分类和系统发育等方面得到广泛应用(Slamaetal., 2014; Bellisetal., 2015)，并可有效鉴别95%的已知库蠓种(Anderetal., 2013)。COⅠ基因在很大程度上弥补了传统形态分类学在鉴定非成虫期及形态残缺标本时的不足。在面对高度近似种时，单纯形态分类的不足就显得尤为突出(Nolanetal., 2007)。本研究基于形态学特征和COⅠ分子标记数据对目前极易产生误判的库蠓属库蠓亚属的3个高度近似种进行分析，研究结果显示形态学和分子数据之间具有高度的一致性，这表明能从分子水平上利用COⅠ基因序列之间的变异快速准确地鉴别刺螫库蠓C.punctatus、灰黑库蠓C.pulicaris和新替库蠓C.newsteadi这3个高度近似种，这也进一步证实了线粒体COⅠ基因序列在库蠓近似种的分类鉴定和系统发育分析方面具有较高的应用价值。

就库蠓近似种遗传距离的研究结果进行统计分析，发现不仅种内遗传距离(0.000～0.014)远小于种间遗传距离(0.181～0.234)，而且种内最大遗传距离(灰黑库蠓C.pulicaris：0.014)亦小于种间最小遗传距离(新替库蠓C.newsteadi与刺螫库蠓C.punctatus：0.181)，此3种的种内遗传距离和种间遗传距离之间无重叠，足以区分这3个库蠓物种。经计算，平均种间遗传距离(0.202)约为平均种内遗传距离(0.007)的29倍，符合Hebert等提出的种间差异大于种内差异10倍的物种鉴定规则(Hebertetal.，2004)，这说明线粒体COⅠ基因是一种理想的分子标记，适用于库蠓近似种之间的种类鉴别。同时，结果还显示采集自贵州、四川、重庆、海南和黑龙江等5个不同生境中的刺螫库蠓C.punctatus的种内遗传距离均不超过0.005；而采集自贵州遵义地区的刺螫库蠓C.punctatus(GZ-12/GZ-13/GZ-101/GZ-103)和荒川库蠓C.arakawai(GZ-1/GZ-2)的种间遗传距离却为0.206。这既说明刺螫库蠓C.punctatus为一广布种，同时也证实了同一物种不同地理种群之间的个体差异小，而不同物种即使是在同一生境下也会由于生态隔离的存在而具有较大的种间个体差异。这与Augot等(2013)关于翅痣库蠓C.stigma和帕罗库蠓C.parroti两库蠓属近似种的研究结果大致相同。

就库蠓近似种系统发育树的建树结果进行分析，发现以二囊亚属的荒川库蠓C.arakawai为外群构建的库蠓亚属3种近似种的NJ树、ML树和Bayes树的拓扑结构是大体一致的。但由于不同建树方法的理论基础以及建树的偏向性方面所存在差异，导致在物种种内亲缘关系的远近上存在微小的差异，这与Gomulski等(2006)基于rDNA-ITS2序列探讨库蠓亚属及其近缘种的系统发生关系所得出的结论是一致的。同时，库蠓近似种的聚类分析与其形态学鉴定结果是一致的，且近似种间各分支都有较高的置信值，说明应用线粒体COⅠ基因构建的分子进化树能分析库蠓近似种之间的亲缘关系且可靠程度较高。然而，在种内一些分支上亦存在相对较低的置信值，如灰黑库蠓C.pulicaris个体之间的置信值中有3个置信值低于50，这在李玮玮等(2009)对小蔗螟的分析研究中也出现了同样的现象。究其原因可能是由于COⅠ序列碱基组成及变异速度存在差异以及COⅠ序列片段提供的有效信息有限所致，如研究中所用的只有50个样本，并且经过Clustal W比对和人工校对后的COⅠ基因序列长度为394 bp，在一定程度无法提供较为全面的有效信息。故在后续的研究中，应从提供更丰富的样本数量和更全面有效信息序列等方面着手。

目前，已有大量研究表明在对双翅目(摇蚊科、麻蝇科)昆虫进行分子鉴定和系统发育分析时联合线粒体DNA、核糖体DNA以及形态学特征进行综合比较分析，其研究结果比仅用线粒体COⅠ基因进行分析得到的结果更为理想，更有研究表明联合COⅠ基因和其他分子标记基因进行类群鉴定的成功率可高达99% (Guoetal., 2011; Carewetal., 2013)。这说明联合多个互补基因序列以及形态学数据综合分析可得到更为全面、准确的种类鉴定和系统发育分析结果。与此同时，也有研究发现COⅠ基因在某些类群的分子系统学研究中并不适用，如腔肠类动物和马达加斯加蛙类等(Hebertetal.，2003)，以及核基因组中线粒体假基因(NUMTs)的存在，也会对库蠓分子鉴定和系统发育分析的结果造成一定程度的干扰。正因如此，新的分子标记的发现和应用也逐渐得到了研究工作者的广泛关注，如编码蛋白基因CAD序列已证实其在很大程度上更有利于分析昆虫的进化关系(Moultonetal., 2004; Wiegmannetal., 2009)，且在库蠓的分子系统学研究中价值亦如此(Bellisetal.，2013；Bellisetal.，2014)。因此，结合多个形态学特征和多个分子标记进行库蠓的物种鉴定和系统发育将更具前途。