几种杀虫剂对烟青虫抗氧化酶的影响

孟令玉，朱承美，刘世涛，曲爱军，温亚萌

山东农业大学植物保护学院，山东泰安岱宗大街61号 271018

烟青虫（Heliothis assulta(Guenée) ），属鳞翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae），是我国烟草生产常见害虫，能造成烟叶产量5%～10%的损失[1-2]。近年来，防治烟青虫效果较好的化学药剂主要有阿维菌素、甲维盐、溴氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、吡虫啉、氯虫苯甲酰胺、丁醚脲等[3-6]。

化学药剂能引起靶标害虫体内解毒酶系统、抗氧化酶系统的变化[7-8]。其中，抗氧化系统主要包括抗氧化酶和抗氧化剂，目前对超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）的研究较多[7]。李周直等人证实，溴氰菊酯处理菜粉蝶（Pieris rapae）、褐边绿刺蛾（Parasa consocia）和褐刺蛾（Thosea pastornata）后，菜粉蝶体内SOD、CAT、POD的活力均有提高，褐边绿刺蛾和褐刺蛾体内SOD、CAT活力随中毒程度加重而不断上升，接近死亡时又急剧下降[9]；阿维菌素和辛硫磷均可导致舞毒蛾幼虫SOD增加[10]；阿维菌素处理榆紫叶甲成虫24 h和36 h后，其体内SOD活性下降[8]。

谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）是生物体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，可催化谷胱甘肽（GSH）产生氧化型谷胱甘肽（GSSG），使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物及促进过氧化氢（H2O2）分解，从而保护生物细胞膜的结构及功能不受过氧化物的损害[11]。目前农药对昆虫谷胱甘肽过氧化物酶影响的研究尚未报道。本研究采用防治烟青虫常用的6种化学药剂处理3龄和4龄幼虫，测定其体内抗氧化酶活性（SOD、CAT、POD和GPX）的变化，以期为更合理解释害虫再猖獗提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫与杀虫剂

供试烟青虫为3龄和4龄幼虫，烟青虫采自山东潍坊烟区2代幼虫。幼虫采回后，置于室内用养虫笼，采集中烟100烟株生长至九叶一心期的第7叶片喂饲幼虫，及时清除虫粪和食物残渣，实验前饥饿12 h。

25 g/L溴氰菊酯乳油（拜耳股份公司），4.5%高效氯氰菊酯乳油（江苏辉丰农化股份有限公司），200 g/L氯虫苯甲酰胺悬浮剂（上海生农生化制品股份有限公司），1.8%阿维菌素乳油（宁波三江益农化学有限公司），5%甲维盐悬浮剂（广东植物龙生物技术股份有限公司）和30%乙酰甲胺磷乳油（山东华阳农药化工集团有限公司）由山东农业大学植保学院农药实验室免费提供。

1.2 药剂处理

本实验杀虫剂用量为产品登记的使用量上限，用蒸馏水按以下有效成份用量分别配制成药液：溴氰菊酯2500倍、高效氯氰菊酯3000倍、氯虫苯甲酰胺7500倍、阿维菌素1500倍、甲维盐4000倍和乙酰甲胺磷350倍。

供试昆虫采用叶片药膜法处理，即选取新鲜中烟100叶片，浸于供试各杀虫剂药液中5 s，叶片置于室内阴凉处，待叶片表面水膜晾干后，喂养烟青虫幼虫6 h后取样，每样3头用于测试，每药剂处理重复3次，以去离子水浸叶为对照。

1.3 测试指标

1.3.1 酶液提取

参照李周直[9]和周建云[12]等人的方法，测定样品幼虫重量，幼虫经磷酸缓冲液（0.02 mol·L-1，pH 7.2）漂洗，擦干后放入适量PBS，冰浴中研磨成匀浆，4℃下，20000 r·min-1离心20 min，上清液即为酶提取液。

1.3.2 测试指标与方法

采用SOD测定试剂盒（A001-3，南京建成生物工程研究所）检测SOD活性，采用CAT测定试剂盒（A007-1-1）检测CAT活性，采用POD测定试剂盒（A084-3）检测POD活性。

采用愈创木酚法[11]测定GPX活性，GPX反应液为100 mmol/L磷酸缓冲溶液(pH 6.0)，含有15 mmol/L愈创木酚、3 mmol/L H2O2。取3 mL反应液，加入20 μL酶液，于470 nm波长下比色，每隔1 min记录吸光度，共记录3次。GPX酶活性以每分钟内A470增加0.01为一个过氧化物酶活性单位（U·mg-1）。

其中，△A470为反应时间内吸光度的变化，V为提取酶液总体积（mL）； Vs为测定时所取酶液体积（mL）；W为样重（g）；T为反应时间（min）。

1.4 数据处理

采用SPSS19.0 处理实验数据。

2 结果与分析

2.1 6种杀虫剂对3龄幼虫抗氧化酶活性的影响

由表1数据可以看出，施药6 h后，6种杀虫剂均能引起3龄幼虫体内SOD、POD、CAT和GPX活性的上升。溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、阿维菌素、乙酰甲胺磷和甲维盐处理后，与对照相比，SOD、POD、CAT和GPX活性均显著上升。其中溴氰菊酯处理后， SOD活性上升了43.24%，POD活性上升了84.49%，CAT活性上升了47.33%，GPX活性上升了31.23%，与对照差异极显著。而氯虫苯甲酰胺处理后，SOD活性虽比对照组上升了4.55%，POD活性上升了3.27%，CAT活性上升了4.12%，GPX活性上升了4.49%，与对照相比差异均未达到显著水平。

表1 6种杀虫剂对3龄幼虫抗氧化酶活性的影响Tab.1 Effects of six insecticides on the activity of antioxidase in three instar larvae

2.2 6种杀虫剂对4龄幼虫抗氧化酶活性的影响

表2中的数据显示，6种杀虫剂处理6 h后，均能不同程度提高烟青虫4龄幼虫体内抗氧化酶的活性。溴氰菊酯处理后，各项抗氧化酶增加最为明显，其中，SOD活性上升了42.05%，POD活性上升了83.02%，CAT活性上升了45.22%，GPX活性上升了30.37%，各项指标与对照差异均显著。与对照相比，高效氯氰菊酯、阿维菌素、乙酰甲胺磷和甲维盐处理后，4龄幼虫体内抗氧化酶的活性均显著上升。氯虫苯甲酰胺处理后，SOD活性与对照相比上升了4.43%，POD活性上升了3.21%，CAT活性上升了4.04%，GPX活性上升了4.11%，但差异均不显著。

表2 6种杀虫剂对4龄幼虫抗氧化酶活性的影响Tab.2 Effects of six insecticides on the activity of antioxidase in four instar larvae

3 讨论与结论

昆虫在逆境胁迫（含农药）下，体内通过抗氧化酶和抗氧化剂系统抵御活性氧损伤，抗氧化酶系统是公认的普遍存在于生物体内的保护酶系统[13]，昆虫在各种胁迫因子作用下，如农药、寄生、紫外线[14]、热、冷等，抗氧化酶和抗氧化物质是消除胁迫途径之一。昆虫体内抗氧化酶主要有SOD、CAT、POD[7,9]、谷胱甘肽还原酶（GR）、硫氧还蛋白还原酶（TrxR）[15]、酚氧化酶（PO）[16]等，抗氧化剂有黑色素[17]、GSH[18]、β-胡萝卜素和维生素E[19]等。

SOD是生物体内抗氧化系统的第一道防线，消除超氧化物阴离子自由基，产生H2O2[20]。褐飞虱（Nilaparvata lugens） 等昆虫在溴氰菊酯等处理后，昆虫体内SOD 活性均有不同程度增加[21,9]，这与本实验结果一致，表明昆虫本身能提高SOD酶活性，以适应农药毒害的影响。POD是由微生物或植物所产生的一类氧化还原酶，主要位于过氧化物酶体中，具有清除过氧化氢，消除胺类和酚类毒性的作用[11]。本研究幼虫经6种杀虫剂处理后，POD活性均较对照有所上升，说明供试杀虫剂能够激活烟青虫体内POD活性，以清除杀虫剂毒害。CAT是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧化酶，是清除细胞内H2O2的主要酶类[22]。在高浓度吡虫啉、低浓度灭幼脲、百树菊酯和功夫菊酯胁迫下，榆紫叶甲成虫CAT活性提高，与本研究结果相吻合，表明CAT也是昆虫应对农药毒害途径之一。GPX的功能是分解是过氧化物和H2O2[11]。本研究幼虫经6种杀虫剂处理后，GPX活性均较对照有所上升，表明GPX也是烟青虫清除供试杀虫剂毒害途径之一。

本研究分别测定了溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、阿维菌素、乙酰甲胺磷、甲维盐和氯虫苯甲酰胺对3龄和4龄烟青虫幼虫体内SOD、POD、CAT和GPX4种抗氧化酶活性的影响。结果表明，经6种杀虫剂处理后，3龄和4龄幼虫体内4种抗氧化酶活性均有上升，且3龄幼虫体内四种酶活性的增幅稍高于4龄幼虫。溴氰菊酯处理的酶活变化最明显，其次为高效氯氰菊酯、阿维菌素、乙酰甲胺磷和甲维盐，与对照均有显著差异，而氯虫苯甲酰胺处理后，4种酶活性与对照相比差异均不显著。

化学农药在生产使用过程中，通常会引起害虫3R问题，而昆虫体内这些抗氧化酶和物质与害虫再猖獗及抗性有何种关系，以及昆虫体内由哪些抗氧化酶和物质组成，均有待于进一步探讨和研究。