生姜黄酮提取工艺优化研究

（南阳理工学院生化学院，河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室，河南南阳473004）

生姜（Zingiber officinale Roscoe）是姜科姜属草本宿根植物的根茎，我国大部分地区均有种植，主要品种有：黄爪姜、红爪姜、来凤姜、野生姜等二十余种。生姜是众多食品加工生产过程中不可或缺的香辛味调料，其含多种化学成分，如：生姜酚、生姜精油、生姜黄酮、姜辣素、姜黄素等[1-6]。研究发现，生姜中含有的生姜黄酮，具有降血脂、降血压、抗心脑血管疾病、抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗氧化、抗衰老等生理活性[7-14]。生姜中的黄酮类化合物是其主要的抗氧化成分，对生姜中的黄酮类化合物进行提取，将其作为食品中的天然抗氧化剂使用，有利于生姜的高值化利用。

植物组织中活性成分提取工艺的研究通常方法是在单因素试验的基础上，采用正交试验设计、回归试验设计等进行多因素试验研究，通过对试验数据进行极差分析和方差分析得到优化结果，或者建立试验指标与影响因素之间的回归方程，通过对回归方程进行寻优求得最佳目标值和各影响因素的最优值。上述试验方法获得的优化结果与实际最佳结果常存在较大的误差。

人工神经网络（artificial neural network，ANN）是对人类大脑神经元处理信息的模拟，可根据输入和输出数据进行学习训练及仿真模拟，网络的信息储存于连接权矩阵之中，适合于各种具有非线性关系数据之间的拟合。误差反向传播（back propagation，BP）神经网络模型是目前应用最广泛的ANN模型。BP神经网络可通过对具有复杂的非线性关系数据进行大量地学习和训练，高效地逼近任意函数，但其在学习及训练过程中存在收敛速度慢、容易受到局部极值的干扰等不足[15-18]。遗传算法是一种具有导向性的概率搜索随机优化算法，可通过计算机程序模拟自然界中生物遗传信息的遗传、选择和变异机制，优化BP神经网络的性能，克服其在学习及训练过程中存在的收敛速度慢、容易受到局部极值干扰等缺陷，从而提高BP神经网络的性能，准确求出形式未知函数的最优解[19-23]。

本文采用BP神经网络对影响生姜黄酮得率的3个显著性的因素与生姜黄酮得率之间的非线性关系进行程序模拟，将通过多次学习及训练后具有较强逼近能力的BP神经网络应用于生姜黄酮得率的预测，在此基础上，利用遗传算法对BP神经网络模型进行全局优化求解，精确求得3个对生姜黄酮得率影响显著的因子的最佳水平，并与单因素试验、析因试验结果相结合，确定生姜黄酮最优的提取工艺参数，以期为生姜黄酮进一步的开发研究提供参考依据。研究中的试验设计采用minitab软件进行，BP神经网络建模的程序编写及遗传算法优化求解采用MATLAB软件进行。

1 材料与方法

1.1 原料

生姜：南阳市长江路万德隆超市。

1.2 试剂

芦丁：中国药品生物制品检定所；乙醇：天津科密欧化学试剂有限公司；石油醚（60℃～90℃）、盐酸：山东嘉颖化工科技有限公司；正丁醇：杭州邦易化工有限公司；氢氧化钠、硝酸铝、氯仿、亚硝酸钠：南京化学试剂股份有限公司；以上试剂均为国产分析纯。

1.3 仪器设备

FW-100高速万能粉碎机、101-2A电热鼓风干燥箱：北京中兴伟业仪器有限公司；HB高精度天平：苏州坤宏电子有限公司；TDL-40B台式高速离心机：上海安亭科学仪器厂；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；752N紫外可见分光光度计：上海仪电科学仪器股份有限公司；SYG-6数显恒温水浴锅：常州朗越仪器制造有限公司；HZQ-Q全温恒温振荡摇床：常州市瑞华仪器制造有限公司；RE-5003E旋转蒸发仪：巩义市宇翔仪器有限公司。

2 方法

2.1 生姜黄酮提取液的制备

将生姜清洗干净，切片，晾干后进行粉碎，粉碎后的原料过40目筛，并用石油醚进行脱脂处理，脱脂后的原料按比例加入不同浓度的乙醇进行浸提，提取液经离心分离后采用sevage法充分脱蛋白即得生姜黄酮提取液。

2.2 生姜黄酮含量的测定

黄酮类化合物在亚硝酸盐作用下，与Al（NO3）3发生络合反应生成黄色铝络合物，在碱性条件下显红色，507 nm波长下有最大吸收波长[24]，因此可采用NaNO2-Al（NO3）3显色法，以芦丁作为标准品制作标准曲线[25]，以507 nm作为检测波长测定吸光值，对比芦丁标准曲线，计算黄酮含量。

2.3 单因素试验

分别称取经石油醚脱脂处理的生姜粉2.0 g，考察不同乙醇浓度（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、提取温度（40、50、60、70、80 ℃）、料液比[1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40（g/mL）]、提取时间（30、60、90、120、150 min）等因素对生姜黄酮得率的影响，实际操作时，每次试验将其中3个因素固定，将样品置于恒温振荡器中，调节振荡速度120 r/min进行振荡提取，提取一次，考查另一因素对生姜黄酮得率的影响。

2.4 析因试验设计

采用Plaekett-Burman试验设计的方法对影响生姜黄酮得率的因素进行试验设计，分别用1、-1代表每个因素中黄酮得率最高和最低的水平[26]。试验的因素水平表如表1所示。

2.5 Box-Behnken试验设计

根据析因试验结果，选取对生姜黄酮得率影响显著的3个因素：乙醇浓度、提取温度、料液比为自变量，每个因素选择3个水平，以生姜黄酮得率为响应值，进行Box-Behnken试验设计[27-28]，具体的因素水平表如下。

表1 Plaekett-Burman试验设计的因素水平Table 1 Factors and levels of Plaekett-Burman experiment design

表2 Box-Behnken试验设计的因素水平及编码值Table 2 Levels of factor and coded value of Box-Behnken experiment design

2.6 BP神经网络模型的建立

在利用MATLAB软件编程时，利用rand函数随机确定Box-Behnken试验结果的12组数据作为拟建立的BP神经网络的学习样本，根据影响生姜黄酮得率的因素个数和待优化指标个数设计BP神经网络的结构，结合试验实际确定BP神经网络的拓扑结构为输入层、隐含层、输出层，输入层有3个节点，分别是乙醇浓度、提取温度、料液比，故输入层神经元选择个数选择3，隐层神经元个数根据经验选择10，输出层只有1个节点，即黄酮得率，故输出层神经元个数选择1；其中输入层传递函数采用logsig函数，隐含层传递函数采用tansig函数，输出层传递函数采用purelin函数[29]；为提高神经网络的逼近能力和泛化能力，选择神经网络的收敛精度为10-3。

2.7 遗传算法优化求解

2.7.1 遗传算法优化求解的原理

将Box-Behnken试验的数据作为BP神经网络的学习样本输入网络进行训练，建立乙醇浓度、提取温度和料液比与生姜黄酮得率之间的非线性映射关系，并将反映此非线性映射关系的“信息”储存在BP神经网络的连接权上，利用神经网络具有的记忆能力形成一个“虚拟”的函数，此函数并无明确的数学表达式，可将其视为非线性的“黑箱”，利用遗传算法优化BP神经网络各层的连接权值，使优化后的BP神经网络能够精确地预测形式未知函数的输出值[30]。

2.7.2 遗传算法全局寻优求解

以BP神经网络的输出值作为待求解的形式未知的函数的适应度值，以Box-Behnken试验的数据作为初始种群，种群规模15，交叉概率0.05，变异概率0.01，重复进行选择、交叉和变异程序，筛选出适应度值最大的优秀基因，从而得到遗传算法优化的结果[31]。

3 结果与分析

3.1 芦丁标准曲线的绘制结果

芦丁标准曲线见图1。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 The standard curve of rutin

以芦丁含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得一元线性回归方程为：

y=0.339 5x+0.007 8，R2=0.997 5

3.2 单因素试验结果

3.2.1 乙醇浓度对生姜黄酮得率的影响

乙醇浓度对生姜黄酮得率的影响见图2。

图2 乙醇浓度对生姜黄酮得率的影响Fig.2 The effect of ethanol concentration on yield of Zingiber officinale Roscoe flavonoids

由图2可知，乙醇浓度为50%时生姜黄酮得率最大，若乙醇浓度大于50%，则生姜黄酮得率随乙醇浓度的增大而逐渐下降，可能是由于乙醇浓度过高时，醇溶性杂质溶出量增大，与黄酮类化合物竞争性地与醇-水分子结合，从而使生姜黄酮得率降低。

3.2.2 提取温度对生姜黄酮得率的影响

提取温度对生姜黄酮得率的影响见图3。

图3 提取温度对生姜黄酮得率的影响Fig.3 The effect of extraction temperature on yield of Zingiber officinale Roscoe flavonoids

由图3可知，提取温度为40℃～60℃时，生姜黄酮得率随提取温度的升高逐渐增大，提取温度为60℃时，生姜黄酮得率最大，若提取温度大于60℃，则生姜黄酮得率随提取温度的升高迅速下降，可能是提取温度过高会加速生姜中黄酮类化合物的氧化，导致生姜黄酮得率下降。

3.2.3 料液比对生姜黄酮得率的影响

料液比对生姜黄酮得率的影响见图4。

图4 料液比对生姜黄酮得率的影响Fig.4 The effect of solid-liquid ratio on yield of Zingiber officinale Roscoe flavonoids

由图 4可知，当料液比小于 1∶35（g/mL）时，生姜黄酮得率随料液比的增加逐渐增大，当料液比为1∶35（g/mL）时，生姜黄酮得率最大，若料液比大于1∶35（g/mL），则生姜黄酮得率迅速下降，可能是由于料液比过大不利于浸提体系的传质和传热，导致生姜黄酮得率下降。

3.2.4 提取时间对生姜黄酮得率的影响

提取时间对生姜黄酮得率的影响见图5。

由图5可知，提取时间在30 min～90 min时，生姜黄酮得率随提取时间的增加，上升趋势明显，若提取时间大于90 min，可能是由于随提取时间的增加，部分黄酮类化合物分解，使生姜黄酮得率呈下降趋势。

图5 提取时间对生姜黄酮得率的影响Fig.5 The effect of extraction time on yield of Zingiber officinale Roscoe flavonoids

3.3 析因试验结果

析因试验结果见表3、表4。

表3 N=4的析因试验设计与响应值Table 3 Factorial experiment design and response value（N=4）

表4 各因素的方差分析表Table 4 Variance analysis of factors

由表 4 可知，提取时间的 P（0.903）＞0.05，故提取时间对生姜黄酮得率的影响不显著，结合单因素试验结果，选择提取时间为90 min进行后续试验。乙醇浓度的 P（0.016）＜0.05、提取温度的 P（0.043）＜0.05、料液比的 P（0.009）＜0.05，说明在显著性水平 α=0.05的条件下，乙醇浓度、提取温度、料液比对生姜黄酮得率具有显著性影响[32]，故选择其作为Box-Behnken试验设计的因子，并对其进行优化。

3.4 BP神经网络模型建立

Box-Behnken试验方案与结果见表5。

表5 Box-Behnken试验方案与结果Table 5 The design and results of Box-Behnken experiment

续表5 Box-Behnken试验方案与结果Continue table 5 The design and results of Box-Behnken experiment

基于Box-Behnken试验的数据，利用MATLAB软件编程时，采用rand函数随机选取12组数据作为BP神经网络的学习及训练样本，建立BP神经网络模型，其余3组数据作为测试样本用以检验所建立的神经网络的泛化能力和逼近能力，BP神经网络的学习及训练过程如图6所示。

图6 BP神经网络学习及训练过程Fig.6 The learning and training process of BP neural network

由图6可知，当采用贝叶斯正则化算法对BP神经网络进行训练时，经9 606次迭代训练，BP神经网络的训练误差平方和达10-3时，神经网络收敛，训练停止。

试验值与BP神经网络预测值的对比如图7所示。

图7 试验值与BP神经网络预测值的对比Fig.7 The comparison between experimental value and predictive value of BP neural network

由图7可知，BP神经网络输出值（预测值）和测试样本的试验值拟合度较好，说明BP神经网络模型具有较强的逼近能力，能较为精确地拟合输入层的样本数据，可用于生姜黄酮得率的预测。

3.5 遗传算法优化求解结果

利用遗传算法对BP神经网络各层的连接权值进行优化，以使适应度值精确地逼近最优解，遗传算法优化求解的轨迹如图8所示。

图8 遗传算法寻优过程Fig.8 The optimizing computation process of genetic algorithm

经过200代选择、交叉和变异操作，遗传算法优化求解的结果为：乙醇浓度58.9296%，提取温度63.0709℃，料液比1∶37.219 8（g/mL），最佳的目标函数值即最优适应度（生姜黄酮得率）为14.749 3mg/g。为便于实际操作，对遗传算法优化求解的结果进行适当修正如下：乙醇浓度59%，提取温度63℃，料液比1∶37（g/mL）。

3.6 最优提取工艺的验证

将单因素试验结果、析因试验结果及基于BP神经网络的遗传算法优化求解修正后的结果相结合，可得生姜黄酮最优提取工艺为：乙醇浓度59%，提取温度 63℃，料液比 1∶37（g/mL），提取时间 90 min，提取一次。根据此条件进行3次重复实验并取平均值，结果为14.685 2 mg/g，变异系数CV即（标准差/平均值×100%）为3.63%，说明结果可信度较高。

4 结论

1）在单因素试验及析因试验的基础上，采用Box-Behnken试验设计安排试验，利用Box-Behnken试验的数据构建BP神经网络模型，用于模拟提取过程中对黄酮得率影响显著的因子与黄酮得率之间的非线性关系，采用贝叶斯正则化算法对建立的神经网络进行训练，经9 606次迭代训练，神经网络收敛，收敛精度达10-3，说明该神经网络模型已具有较强的泛化和逼近能力，可将其应用于生姜黄酮提取工艺参数的预测求解。

2）利用遗传算法对所建立的BP神经网络进行全局寻优，并结合实际条件，将遗传算法优化求解结果及单因素试验、析因试验结果相结合，可得生姜黄酮最优提取工艺为：乙醇浓度59%，提取温度63℃，料液比 1 ∶37（g/mL），提取时间 90 min，提取一次。根据此条件进行3次重复试验并取平均值，结果为14.685 2 mg/g。

综上所述，BP神经网络模型具有较高的仿真精度，能够较为精确地拟合对生姜黄酮提取有显著影响的因素与得率之间的非线性关系，其在提取工艺参数优化方面具有较强的泛化和逼近能力，并且与遗传算法结合经过多次世代进化即可完成全局寻优求解，获得最优的、最接近客观实际的提取工艺参数，此方法也为其他具有开发应用潜力的农产品中黄酮类化合物的提取研究提供了新的思路。