NF-κB通路在自身免疫性甲状腺炎发病过程中的作用

祁岗 朱艳媚 李焱 李玉娟 罗世文 李曼

1青海省人民医院（西宁810007）；2青海大学医学院（西宁810016）

自身免疫性甲状腺疾病（autoimmune thyroid disease，AITD）是病变部位主要发生在甲状腺的器官特异性自身免疫性疾病［1］，主要包括Graves病（GD）和桥本甲状腺炎（Hashimotos thyroiditis，HT）。AITD的发病机制尚未完全清楚，而越来越多的研究发现甲状腺细胞炎症相关信号转导异常、炎症反应失衡与自身免疫性甲状腺疾病有很大的关系［2-3］。研究发现在AI组织中，TNF-α、IL-1β、IFN-γ等炎症因子高表达［4］，其中 TNF-α 是NF-κB 通路的激活因子和效应子，其表达变化即受到NF-κB信号通路的调控，同时反过来又去调控NF-κB通路，二者相互调控形成正反馈环，加重炎症［5］。作为重要的炎症信号通路，NF-κB通路在多种炎症疾病中异常激活，与炎症发生发展密切相关［6-7］，已经发现在甲状腺癌组织及其细胞中NF-κB通路异常激活，促进甲状腺癌的发展［8-9］，但是其在AITD发病过程中的作用并未被阐明。为此本研究将以NF-κB通路作为基础，研究自身免疫性甲状腺炎发病的分子机制，为临床治疗AITD提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料昆明小鼠，清洁级，雌性，6～8周，体质量18～22 g，购买自兰州大学动物实验中心，许可证号：SYXK（甘）2015-0005。CBA/j小鼠，清洁级，雌性，5～6周，体质量16～20 g，购买自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（京）2014-0004。

上述小鼠均在在相对恒定温度和相对湿度（25～27℃、40%～50%）条件下，12 h自然采光，按照清洁级标准采用标准饲料进行饲养。小鼠适应性饲养1周后，观察无异常表现者即可入组进行实验研究。该饲养条件贯穿整个实验过程。标准饲料购买自北京科澳协力饲料有限公司，Sephadex G-200凝胶购买自索莱宝生物科技有限公司，完全弗氏佐剂（complete Freund′s adjuvant，CFA）和弗氏不完全佐剂（Freund incomplete adjuvant，FIA）购买自北京索莱宝生物科技公司，TNF-α ELISA试剂盒购买自上海酶联生物科技有限公司，SP9001免疫组化试剂盒、RIPA裂解液、超敏型ECL检测试剂、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、SDSPAGE蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE电泳液以及蛋白质印迹转膜液均购自上海碧云天生物技术有限公司；NF-κB、IKK抗体均属于兔单克隆抗体，皆购自Abcam公司；HRP标记的山羊抗兔IgG购买自CST公司，Trizol、逆转录试剂盒、实时定量PCR试剂盒购买自Takara，引物有Takara公司。引物信息：TNF-α：上游5′-CCTCTAGCCCACGTCGTAGC-3′，下游5′-AGCAATGACTCCAAAGTAGACC-3′；Bcl-2：上游5′-TGACCCGCAGCAAGAAAGTG-3′，下游 5′-ATCTGTGGAGAAGACAGCTA-3′；ICAM-1：上游 5′-GACCACGGAGCCAATTTCTCA-3′，下游5′-TCCAGTTCCCCAAGCAGTCC-3′；β-actin：上游5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′，下游 5′-TAAAACGCA GCTCAGTAACAGTCCCG-3′。

1.2 方法

1.2.1 mTg蛋白纯化将昆明小鼠的甲状腺置于4℃预冷的0.01 mmol/L的PBS中，研磨成匀浆液后，4℃3 000 r/min，离心30 min，取上清再经4℃10 000 g，离心1 h后，经饱和度为42%、37%和42%硫酸铵3次沉淀，PBS重悬，4℃充分透析48 h，换液6次，去除硫酸铵，透析后冻干，进行Sephadex G-200凝胶层析纯化，将纯化后的收集物用蒸馏水透析，聚乙二醇20000反透浓缩，冷冻干燥，将上述方法再次进行凝胶层析。最后将mTg冷冻干燥，保存于-70℃冰箱。

1.2.2 mTg蛋白鉴定将纯化的蛋白加入4×上样缓冲液，煮沸变性后，加到4%浓缩胶浓缩，10%分离胶分离，然后用考马斯亮蓝R250染色，根据条带的分子量鉴定是否为甲状腺球蛋白。

1.2.3 动物饲养及造模参照文献［10］进行造模：于8周龄时，将CBA/j小鼠随机分为两组，每组10只，其中对照组（control组）给予水+CFA，模型组（mTg组）给予100 μg/鼠的mTg+CFA皮下注射初次免疫，10周龄时模型组再给予相同mTg+FIA重复免疫1次，14周龄时处死小鼠，取血清及甲状腺组织进行检测，并参照HE染色结果对模型进行评价。

1.2.4 HE染色摘取甲状腺组织，PBS洗涤后，4%多聚甲醛固定1周后，经脱水后，石蜡包埋，切成4 μm切片，进行HE染色。光镜下观察甲状腺组织的炎症细胞（包括淋巴细胞、浆细胞、嗜中性粒细胞）浸润程度，EAT炎症分级标准：＜1级为正常，≥ 1、＜ 2级为轻度，≥ 2、＜ 3级为中度，3～4级为重度。

1.2.5 ELISA实验眼球取血后，将血液于室温放置30 min，待其凝固后，3 000 r/min离心10 min，取血清，按照说明书进行ELISA实验，450 nm波长测量各孔OD值。

1.2.6 qPCR实验用Trizol法提取甲状腺组织总mRNA，然后按照Takara反应试剂盒依次经过去除基因组DNA反应、反转录反应和qPCR进行扩增，扩增程序为：预变性：95℃、10 min、1循环数；扩增：95 ℃、15 s，60 ℃、15 s，72 ℃、30 s、40循环数。

1.2.7 Western bloting实验甲状腺组织中加入RIPA裂解液，置于冰上研碎至匀浆后，4℃放置30 min，13 000 r/min离心10 min，取一部分上清，BCA试剂盒检测蛋白浓度，另一部分上清加入4×上样缓冲液，煮沸变性后，进行SDS-PAGE凝胶电泳，经4℃孵育一抗、室温孵育二抗、ECL发光液显色、X医用胶片显影、定影等步骤，最后进行拍照分析。

1.2.8 免疫组化实验按照SP免疫组化试剂盒说明书进行实验。甲状腺组织切片经过抗原热修复、封闭、依次孵育一抗、生物素标记的二抗、辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素后，DAB显色液显色，至显色程度适宜，终止反应。苏木素复染2 min，用自来水冲洗切片，盐酸酒精分色，洗涤后，将切片脱水、二甲苯透明，中性树胶封片，晾干后拍照分析。

1.3 统计学方法数据分析采用SPSS 21.0软件包，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，均以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 蛋白纯化及鉴定由图1可知，在纯化mTg过程中，图1A中第一个峰代表丙酮分子，单一平滑表明柱子安装合格。第二个峰图代表分离纯化的甲状腺球蛋白，文献报道在甲状腺中，甲状腺球蛋白分子量是最大的，因此第二个峰推测即为甲状腺球蛋白，进行收集。为验证是否为甲状腺球蛋白，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，图1B中三条带为稀释不同浓度的收集的纯化蛋白，根据分子量显示分析为甲状腺球蛋白且蛋白纯度较高，达到实验动物造模的要求。

图1 甲状腺球蛋白的纯化与鉴定Fig.1 Purification and identification of thyroglobulin

2.2 病理变化与Control组相比，mTg组甲状腺组织可见甲状腺滤泡体积变小，数量明显增多，形状不规则，滤泡间壁膜增厚，细胞增多，可见大量炎症细胞浸润。评分后，mTg组甲状腺组织炎症严重程度均达到3级以上，可见10%～40%的甲状腺组织被炎症细胞取代；或超过40%的甲状腺组织被炎症细胞取代。见图2。

图2 甲状腺组织病理变化Fig.2 Pathological changes in thyroid tissue

2.3 血清中TNF-α含量变化与对照组相比，mTg组血清中TNF-α含量显著上升，差异具有统计学意义（P＜0.01）。见表1、图3。

2.4 甲状腺组织中TNF-α、Bcl-2、ICAM-1 mRNA变化与对照组相比，mTg组甲状腺组织中TNF-α mRNA、Bcl-2 mRNA、ICAM-1 mRNA表达明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.01）。见表2、图4。

表1 小鼠血清中TNF-α浓度变化Tab.1 Changes of TNF-α levels in mice serum ±s，ng/L

表1 小鼠血清中TNF-α浓度变化Tab.1 Changes of TNF-α levels in mice serum ±s，ng/L

注：与Control组比较，**P ＜0.01

分组Control组mTg组TNF-α 83.37±11.39 185.42±13.36**

图3 小鼠血清中TNF-α浓度变化Fig.3 Changes of TNF-α levels in mice serum

表2 各组小鼠甲状腺组织中TNF-α、Bcl-2、ICAM-1 mRNA变化Tab.2 Changes of TNF-α，Bcl-2 and ICAM-1 mRNA level in thyroid tissue ±s

表2 各组小鼠甲状腺组织中TNF-α、Bcl-2、ICAM-1 mRNA变化Tab.2 Changes of TNF-α，Bcl-2 and ICAM-1 mRNA level in thyroid tissue ±s

注：与Control组相比，**P＜0.01

分组Control组mTg组TNF-α 1.00±0.00 2.38±0.13**Bcl-2 1.00±0.00 2.11±0.12**ICAM-1 1.00±0.00 2.24±0.13**

2.5 甲状腺组织中NF-κB蛋白变化与对照组相比，mTg组甲状腺组织中NF-κB蛋白表达明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.01）。见表3、图5。

表3 各组小鼠甲状腺组织中NF-κB蛋白表达变化Tab.3 Changes of NF-κB protein in thyroid tissue ±s

表3 各组小鼠甲状腺组织中NF-κB蛋白表达变化Tab.3 Changes of NF-κB protein in thyroid tissue ±s

注：与Control组相比，**P＜0.01

分组Control组mTg组NF-κB 0.52±0.07 0.93±0.11**

2.6 甲状腺组织中IKK蛋白变化与对照组相比，mTg组甲状腺组织中IKK蛋白表达明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图6。

3 讨论

图4 甲状腺组织中TNF-α、Bcl-2、ICAM-1 mRNA变化Fig.4 Changes of TNF-α，Bcl-2 and ICAM-1 mRNA level in thyroid tissue

图5 甲状腺组织中NF-κB蛋白变化Fig.5 Changes of NF-κB protein in thyroid tissue

图6 甲状腺组织中IKK蛋白变化Fig.6 Changes of IKK protein in thyroid tissue

为了给临床治疗提供一定的理论依据，本研究通过建造自身免疫性甲状腺炎模型探索其发病机制，在造模过程中用CBA/j小鼠，采用多次注射mTg进行免疫的造模方法，建造自身免疫性甲状腺炎模型。HE染色结果发现模型组小鼠在造模完成后，甲状腺组织中大量炎症细胞浸润，导致滤泡明显增多，体积减小，泡间壁厚度增厚，滤泡呈明显不规则样，可见明显的发炎症状，提示造模成功。

AITD作为免疫性疾病，其发病多与免疫细胞、免疫因子及其免疫相关信号通路相关。近年来研究发现，在甲状腺血管中TGF-β、TNF-α、IL-1α、IL-8等炎症因子的高表达，促进了甲状腺的炎症介质、黏附分子、趋化因子和一些相关酶类的过度或持续表达［11-12］，与本研究结果一致，在自身免疫性甲状腺疾病模型鼠血清中TNF-α含量明显增加。TNF-α作为最重要的炎症介质之一，其高表达不仅导致炎症部位细胞释放大量炎症介质和趋化因子，同时激活体内的炎症细胞，加重炎症［13］。TNF-α可激活体内多条炎症相关信号通路［13］，包括NF-κB信号通路，同时TNF-α基因含有NF-κB的特异性结合位点，即TNF-α的表达可受NF-κB的调控，因此TNF-α与NF-κB信号通路可形成正反馈环［15］，相互促进，使炎症进一步加重。这种正反馈环在很多疾病中被发现，参与疾病的炎症反应。在本研究中发现NF-κB在模型组小鼠甲状腺组织中表达显著升高，同时作为NF-κB的激活因子IKK的表达在模型组甲状腺组织中同样显著升高，以上提示NF-κB信号通路在自身免疫性甲状腺模型组织中被激活。其可能与TNF-α形成正反馈环，促进AITD的发生发展，但具体机制还需进一步实验证实。激活的NF-κB不仅调控TNF-α的表达，同时可启动下游与凋亡、存活、增殖、迁移等相关蛋白的表达，广泛参与炎症反应、免疫应答、细胞增殖和细胞凋亡等多种生理、病理过程的基因调控［16］，其中凋亡相关蛋白Bcl-2以及黏附迁移相关蛋白ICAM-1基因的启动子中皆含有NF-κB转录因子识别结合序列，二者受NF-κB的激活调控［17-18］。已有研究表明在炎症组织中Bcl-2高表达抑制炎症细胞凋亡，促进细胞增殖，加重炎症［19］，而ICAM-1在炎症组织中高表达可促进炎症细胞的浸润［20］，研究发现在炎症过程中血管内皮细胞表达的ICAM-1不仅介导淋巴细胞与血管内皮细胞的黏附，促使淋巴细胞向炎症部位浸润并释放多种炎性因子，而且炎症组织中炎性因子又可刺激诱导血管内皮细胞表达ICAM-1，从而促使更多的细胞向炎症部位迁移［21］。本研究发现模型组小鼠甲状腺组织中Bcl-2 mRNA、ICAM-1 mRNA高表达，提示其可促进AITD炎症的发生、发展，并且其高表达可能是由NF-κB的异常表达造成的。

综上可知在自身免疫性甲状腺炎发病过程中，NF-κB通路异常激活，并与TNF-α形成正反馈环导致NF-κB通路持续激活，启动Bcl-2和ICAM-1基因表达，促使炎症细胞增殖、浸润至甲状腺组织，促进AITD的发生发展。