从罗非鱼皮中提取与纯化非变性胶原蛋白的方法的研究

王月林 何兰 郭休玉 陆雪荣

（上海市水产研究所水产品加工与饲料研究室 上海 200433）

天然高分子胶原来源广泛，可以从陆生动物如猪、牛的皮、骨、腱等部位获取，也可以从水生动物中如鱼皮鳞中获取。由于陆生生物安全性问题日益受到人们的关注，很多国家和地区都限制了陆生生物来源胶原蛋白制品的使用范围，而水生生物的皮、骨、鳍等含丰富的胶原蛋白, 被国内外学者认为是安全的胶原蛋白来源。本项目组以水产加工废弃物罗非鱼皮为原料，通过原料前处理、胶原提取、胶原纯化等方法的研究，探讨罗非鱼皮非变性胶原蛋白的产业化路线。

1.材料与方法

1.1 原料前处理

1.1.1 从水产养殖厂购买新鲜罗非鱼皮，清洗去鳞取皮，去除附着鱼肉和鱼鳍，切成2cm*2cm小块，备用。

1.1.2 适量浓度的NaCl溶液清洗鱼皮，料液比1∶10（w/v），4 ℃以下，每隔12hr更换一次溶液，重复4次。

1.1.3 再更换0.1mol/L的NaOH溶液清洗鱼皮，料液比1∶10（w/v）4℃以下，每隔12hr更换一次碱液，重复4次，再用去离子水反复清洗至pH6.5～7。

1.2 提取粗胶原

1.2.1 酸溶性胶原的提取 将前处理后的鱼皮放入0.5mol/L的乙酸溶液中，料液比1∶20（w/v），缓慢搅拌6hr后，过滤，取上清。重复上述酸溶步骤一次，合并滤液获得酸溶性胶原ASC（acid-soluble collagen）。

1.2.2 酶溶性胶原的提取 1.2.1中过滤所得滤液中加入0.2%的胃蛋白酶，4℃酶解48hr，即获得胃蛋白酶水解胶原PSC（pepsine-soluble collagens）。

1.3 胶原的纯化

1.3.1 分级过滤 将酶溶性胶原溶液经多次膜过滤，去除少量杂质。

1.3.2 盐析 将滤液里加入饱和NaCl溶液至终端浓度为4%，静置4hr，4℃离心30min，10000g，取沉淀的胶原。

1.3.3 透析 将盐析获得的胶原沉淀重新溶于纯水或稀酸中，控制适当的料液比，轻微搅拌(80rpm)，装入100KD截留分子量的透析袋中，透析外液为纯水。

1.3.4 冻干 将经透析纯化的胶液用-60℃冷冻干燥机冻干。

1.4 得率计算

2.实验结果与讨论

鱼皮的表皮起源于外胚层，鱼皮薄而柔软，角质化程度低，鱼皮的前处理与陆栖动物不同。鱼皮组织结构比较松散，脂肪和色素的含量较高，且不同种的鱼皮的组织结构、色素脂肪有较大差异，所以加工工艺有所不同。鱼皮中的结构蛋白主要为胶原蛋白，占80%以上，还有少量弹性蛋白和角蛋白。

本项目组对罗非鱼皮主要化学成分进行了检测：水分67.4%，灰分1.3%（湿基），蛋白质28.4%（湿基），脂肪1.1%（湿基），这些基本成分与叶小燕（2008）所测得的数据基本相似。

2.1 关于鱼皮前处理

由于鱼皮表面有色素、粘液等非胶原蛋白成分，我们选择了NaCl作为清洗剂清洗鱼皮。为了获得最佳的清洗浓度与实践，本项目组设计了单因素实验，即分别以3%，5%，8%浓度的NaCl溶液清洗鱼皮60hr，每12hr更换一次同浓度NaCl溶液，并抽取清洗的液体，用紫外分光光度计检测A280处的吸光度，确定清洗程度。

图1 不同盐浓度清洗罗非鱼皮实验结果

由图1可以看出，三个浓度的溶液在12hr时清洗效果差异不大，但24hr后，3%的NaCl溶液清洗时吸光度一直保持在高位，历经60hr鱼皮仍未清洗干净。5%和8%浓度的NaCl溶液清洗在逐步递减，48hr和60hr的数据差异不大，肉眼观察清洗料液较清澈，判断在48hr时鱼皮已经清洗干净。

考虑到成本控制及污水处理等产业化生产需关注的问题，我们选择5% NaCl溶液作为清洗剂，每12hr更换一次溶液，清洗48hr，作为盐洗操作参数。

盐洗后，为了利于胶原的浸出，我们选择0.1mol/L NaOH溶液进行清洗鱼皮，既能疏松胶原纤维之间的紧密连接又可去除鱼皮中的少量脂肪。碱洗操作参数定为：0.1mol/L NaOH溶液1∶10 料液比，清洗4次，每次12 hr。

2.2 关于提取胶原

胶原蛋白是酸溶性蛋白，本项目组选用0.5mol/L的乙酸溶液作为抽提剂。这一步是制备胶原蛋白的关键，直接影响着胶原蛋白的得率。我们采用四个抽提料液比，即1∶30,1∶40,1∶50，1∶60，鱼皮溶胀 12hr后，轻微搅拌料液，纱网过滤，得到第一道胶液，胶液称重；获得的残渣再次分别加入乙酸溶液，第二次溶胀，12hr后过滤，得到第二道胶液，胶液称重。经过后续的酶解，纯化，冻干后，得到胶原蛋白干品，计算得率。

图2 不同浓度提取罗非鱼皮胶原蛋白得率

不同比例的抽提液较大的影响着胶原蛋白的得率。1∶30实验组，第一道和第二道料液浓度分别为0.33%和0.31%，相差无几。可以认为，胶原蛋白在酸液中达到一定浓度后，就很难再浸出，只有通过提高酸液的体积来提高胶原蛋白的浸出。1∶50比例实验组的料液浓度0.19%，虽然低于1∶30和1∶40实验组，但是总得率却高于这两组。1∶60实验组总得率与1∶50相差不多，因此，提高抽提液浓度不能无限扩大胶原的得率。

综上所述，本项目组确定的酸溶性胶原的提取工艺参数为前处理后的鱼皮经0.5mol/L乙酸溶液抽提两次，1∶50料液比。

酸溶性胶原提取后，为了进一步降低其抗原性，更利于生物医用材料领域的利用，我们选择胃蛋白酶进行端肽酶切，获得低抗原胶原蛋白。经实验反复验证，我们选定0.1%～0.2%胃蛋白酶，在4℃条件下，酶解6hr～8hr为宜。

2.3 关于胶原蛋白的纯化

医用级胶原蛋白对产品的纯度有着极高的要求，纯度高于95%以上。因此，控制杂蛋白，提高胶原纯度始终贯穿于整个工艺路线中。

在酶溶性胶原酶解后，对胶原料液进行盐析。在稀酸条件下，胶原蛋白分子在1.0～2.0mol/LNaCl时能被沉淀。我们配置饱和NaCl溶液，缓慢加入料液中，边加边搅拌。分别设计两平行实验，一份中加入4%终浓度NaCl，一份中加入5%终浓度NaCl，结果显示，两者所得沉淀相差无几，可见4%浓度足够让胶原蛋白完全盐析。见表1。

表1 胶原蛋白料液盐析表

经过初步纯化的胶原蛋白，其中仍含有大量NaCl（盐析引入）及少量蛋白多肽或小分子杂蛋白，采用透析的方法可以将其去除。

2.4 关于胶原蛋白的得率

胶原蛋白的得率与提取胶原步骤息息相关，根据实验设计，我们将经过纯化的胶原蛋白冷冻干燥后，计算了料液比分别为1∶30，1∶40，1∶50，1∶60 的酸溶性胶原蛋白 ASC、酶溶性胶原蛋白PSC的得率，结果如下表：

结果显示：1∶50组为11.56%，1∶60组为 11.61%。得率均达到11%以上，远高于本项目组前期做的鱼鳞胶原蛋白的得率，更适合产业化生产。

表2 罗非鱼皮胶原蛋白得率计算

3.结论

3.1 鱼皮前处理

5%NaCl溶液作为清洗剂，1∶10料液比，每12hr更换一次溶液，清洗48hr；0.1mol/L NaOH溶液1∶10料液比，清洗4次，每次12hr。

3.2 提取粗胶原

0.5 mol/L乙酸溶液抽提两次，0.1%～0.2%胃蛋白酶，在4℃条件下，酶解6hr～8hr。

3.3 胶原蛋白的纯化

分级过滤，使料液与黑色素、杂质等分离；对胶原料液进行盐析4%终浓度NaCl对胶原料液进行盐析；透析进一步纯化。

3.4 鱼皮胶原蛋白的得率达到11%以上，鱼鳞胶原蛋白的得率仅为5%，因此鱼皮胶原蛋白的制备更适合推广产业化生产。