内淋巴囊瘤的临床和VHL基因突变分析研究

郝瑾许丽萍鲜军舫李永刘辉陈树斌李永新

北京市首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科(北京1100730)

北京市首都医科大学附属北京同仁医院放射科（北京2100730）

北京市首都医科大学附属北京同仁医院神经外科（北京3100730）

首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科中心北京市耳鼻咽喉科研究所

耳鼻咽喉头颈科学教育部重点实验室（4100005北京）

内淋巴囊瘤(Endolymphatic sac tumor,ELST)是一种罕见的内耳肿瘤，它来源于内淋巴上皮，在前庭导水管的内淋巴管/囊骨内部分发生。ELST富血管，在组织学上以乳头状和腺管状为其特点。ELST最初由Hassard在1984年发现[1]，1989年Heffner描述了一组由20名患者组成的病例系列，他们的颞骨有一致的组织学改变，为乳头状上皮肿瘤，岩骨的后壁受侵，Heffner将它们称之为“可能的内淋巴囊来源的低级别腺癌”[2]。目前国际上公认的说法是ELST[3]。

ELST为缓慢生长的良性肿瘤，但具有侵袭性，可浸润岩骨，并破坏迷路[4]，导致前庭蜗神经功能障碍。ELST的典型症状包括耳鸣（约92%）、眩晕和平衡不稳（约62%）和感音神经性听力下降（约95%）。感音神经性听力下降可突然发生（约43%）也可呈渐进性的（约43%），严重时表现为全聋。ELST相关的感音神经性听力下降和前庭病变可因肿瘤相关的迷路内出血或内淋巴积水而突然发生，而和肿瘤大小无关。感音神经性听力下降常发作在较年轻的时候，约22岁左右，且为不可逆的。在诊断ELST时，听前庭障碍往往已经存在多年。为避免不可控的生长导致的硬膜内侵犯和脑组织受压，治疗上应早期手术完全切除，在某些病例可从而保留听力，稳定感音神经性听力下降的进展[4]。

ELST可以散发，也可以作为常染色体显性遗传的VHL病的一个表现。大约10～15%的VHL患者会发生ELST，其中的30%为双侧发病。ELST的发生没有性别差别，通常在30多岁早期～40多岁出现临床症状[3]。

VHL抑癌基因最初被定位在染色体3p25上，随后被确认。VHL抑癌基因（HGNC:12687;Ensembl:ENSG00000134086; MIM:608537; Vega:OTTHUMG00000128668）编码的蛋白质（protein VHL,pVHL）和elongin B,elongin C和cullin-2一起组成蛋白质复合体，具有泛素连接酶E3的活性，参与低氧诱导因子（hypoxia inducible factor,HIF）的泛素化和降解，HIF是转录因子，在诸多需氧的基因表达调控上起关键作用。前期在VHL病的肾细胞癌、嗜铬细胞瘤、成血管瘤和胰腺囊腺癌等研究中发现支持Knudson假说，即遗传的胚系突变和VHL基因的野生等位基因的功能丧失在肿瘤发生上都是必不可少的。而在散发病例中，则认为VHL抑癌基因的两个等位基因都发生了体细胞突变。目前，国际上对于ELST单纯型推荐进行基因检测和遗传咨询[5]。

ELST起病较为隐匿，早期表现只是单侧的耳鸣和／或听力下降，可以伴随或不伴随前庭神经功能障碍，往往不能引起临床医生的重视而漏诊。为了加深对此病的了解，并进一步研究ELST病例中VHL基因突变的情况，我们将近年来我院耳鼻咽喉头颈外科和神经外科共同诊治的ELST病例进行临床资料的总结，结合VHL基因突变情况进行分析。

1 资料与方法

1.1 临床资料

通过电子病历系统检索2006.01～2018.04在我院就诊手术，经术后病理检查确诊为ELST的患者，共4例（2男、2女），中位年龄40.5岁（15～62岁）。除病例1因“口角右偏9月，声嘶4月”来诊外，病例2、病例3和病例4均主因单侧耳鸣就诊（见表1）。

1.2 影像学检查

患者手术前后均行CT和/或MR检查。颞骨CT扫描参数140kVp，120mAs，FOV 180mm，矩阵512×512，加迭代算法，窗宽窗位4000/700 Hu，以层厚1mm，间隔1mm进行多平面重组，获得横断、冠状与双斜矢四组图像。颅脑CT采用螺旋扫描，窗宽窗位4000/700 Hu与80/30 Hu，重组得到横、冠、矢状位图像。上腹CT平扫+增强扫描（动脉期、静脉期、延迟期三期），窗宽窗位350/40 Hu，常规重组。内耳MRI扫描序列为冠状位T2WI，横断位T1WI、T2WI，水成像，根据临床需要加做DWI序列或增强序列。颅脑MRI扫描序列为横断位T1 FLAIR、T2 FLAIR，DWI，增强后的横断位、冠状位T1 FLAIR。颅脑MRA采用横断面三维时间飞跃技术（3D TOF），MRV采用冠状面或矢状面的2D TOF技术。因三位患者的检查所使用仪器的生产厂家和设备型号不同，具体扫描参数和序列名称会有细微差别。

1.3 听力学检查

所以有受试者均进行了听力学检查，测试在符合国家标准的隔声屏蔽室内进行，室内噪声≤30dBA。纯音听阈测试：采用丹麦科丽娜（Conera）诊断型听力计，用上升法分别测试气导和骨导听阈。声导抗：采用GSI-TympstarⅡ中耳分析仪，用226Hz探测音分别测试双耳鼓室声导抗和声反射。畸变产物耳声发射：采用国际听力（Interacous-tic）Titan耳声发射分析仪，选用两个强度差为10dB的纯音信号f1和f2（l1=65dB SPL，l2=55dB SPL，f1/f2=1.2），以信噪比≥5dB做为是否记录到DPOAE的标准。听性脑干反应：采用国际听力（Interacoustic）Eclipes听觉诱发电位仪，参考电极置于乳突，记录电极置于前额发际，鼻根接地，极间电阻≤3 kΩ，用插入式耳机给予交替极性短声，刺激速率为20.1次/秒，带通滤波100～3000Hz，开窗时间15毫秒，叠加2000次。

表1 ELST病例系列入院基本资料Table 1 Basic information of the ELST case series on admission

表2 ELST病例系列手术信息Table 2 The operation of ELST case series

1.4 手术治疗

本组4例患者均在院内多学科会诊共同商议治疗方案后，由我院耳科和神经外科联合施行手术。因病例1病变范围较大，首诊时已经出现面瘫、全聋和后组颅神经症状，采用颞枕入路。病例2、病例3和病例4都采用了经乳突入路（见表2）。

1.5 VHL基因检测

经过病史询问，病例1为抱养，无法追溯其家族史，病例2、病例3和病例4均否认家族史。和患者及家属沟通后，病例3积极配合，愿意配合进行VHL基因检测，在签署知情同意书后遂取其外周血、ELST标本和肾脏肿瘤标本，因其育有两子，亦愿意进行VHL基因检测，留取病例3两子外周血标本，共计5个样本。我们进行VHL基因CDS+splicing15bp进行sanger法测序，共设计3对PCR引物。引物用在线Primer3软件设计(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)。PCR引物为：VHLP1F1:ATTTCCGCGAGCGCGTTCCAT,VHLP1R1:AAAATGGACCC CGGGGCGGTA;VHLP2F1:GTGTGGCTCTTTAACAA CCTTTG,VHL P2R1:CACAATTTGGCCAGGGAAACA;VHLP3F1:GCAAAGCCTCTTGTTCGTTCC,VHL P3R1:GAAGCAAAAATGCCACCACCTT。PCR产物经虾碱酶(SAP)(from Promega)和外切酶I(EXO I)(from Epicentre)纯化后用ABI公司的BigDye3.1试剂盒测序。测序产物上ABI3730XL测序仪，测序文件用Polyphred软件分析，并结合人工校对记录后整理出结果。

1.6 随访

所有患者术后当晚都进行颅脑CT的检查。在患者及家属配合的情况下，术后3～6月门诊进行影像学复查。对该病例系列的4名患者均进行电话随访（术后6月～35月）。并对检测VHL基因的患者及家属开展遗传咨询。

病例1术后35月电话随访，一般情况尚可，但是拒绝来医院进一步检查。病例2术后复查内耳MR，ELST切除完整（图1，Q和R），每年复查腹部B超，未发现占位性病变。病例3在ELST住院期间发现左肾占位（图1，P），行肾脏肿物切除后，诊断为“左肾癌T1N0M0”，病理报告显示透明细胞肾细胞癌（I-II级）。术后半年复查颞骨和腹部CT未见明显异常。病例4术后3个月复查内耳MR，ELST完整切除，未见复发征象。肾囊肿暂观察，未行手术治疗。

2 结果

2.1 ELST的影像学表现

ELST颞骨CT表现为内淋巴囊区类圆形膨胀性骨质破坏，局部呈虫蚀样。内耳MR表现为混杂T1长T2信号影，边缘呈分叶状，部分其内见液-液平面，增强后病变不均匀明显强化（详见图1）。此外，为了除外VHL病其他脏器受累，进行了平扫+增强腹部CT检查，发现病例3左肾肿瘤（图1，P），病例4右肾囊肿（图1，O）。

图1 ELST的CT和MR表现。病例1.A B分别为轴位和冠状位颞骨CT影像，颞骨鼓室、乳突部、岩部可见巨大不规整软组织密度影，累及颞下颌关节、内耳、中后颅窝、颈动脉管、颈静脉窝、内听道、斜坡。C D分别为轴位和冠状位MR影像，左侧颞骨乳突部、岩部、鳞部后方及岩枕裂可见巨大膨胀性不规则形软组织影，边界清晰，以等、短T1信号，等长T2信号为主，内部信号不均匀并见多个液平，增强后可见部分实性强化软组织影。病例2.E F显示右侧岩骨后缘、前庭导水管区见类圆形膨胀性骨质破坏，局部呈蜂窝状，虫蚀样。G H显示右侧内淋巴囊区域混杂短T1长T2信号影，边缘呈分叶状，病灶中心为长T1短T2信号，增强后明显强化，边缘呈短T1长T2信号，部分其内见液-液平面。病例3.IJ显示左侧内淋巴囊区骨质破坏，K L显示左侧内淋巴囊区可见不规则略混杂T1长T2信号影，局部可见血管流空信号，边缘可见分叶，增强后病变不均匀明显强化。P为病例3腹部CT增强影像，显示左肾下极肿物。病例4.M N颞骨CT显示右侧内淋巴囊压迹增宽，邻近骨质破坏，边缘毛糙。O双肾CT平扫+增强、多平面重建显示右肾小囊肿（Bosniak II型）。Q R为病例2术后复查MR可见术腔由脂肪组织充填，结构显示清晰，未见明显占位性病变。红色箭头指示病变范围，蓝色箭头指示前庭蜗神经所在部位，黄色箭头显示肾脏肿物。Fig.1 CT and MR manifestations of ELST cases.Case 1.A and B showed the axial and coronal CT scanning of temporal bone.The shadow of huge soft tissue with rough rim was found in the tympanic,mastoid and petrous part of the temporal bone.Temporo-mandibular joint,inner ear,mid-posterior cranial fossa,carotid canal,jugular fossa,inner auditory canal and clivus were involved.C and D indicated the axial and coronal MR imaging.In the mastoid,petrous and squamous parts of the left temporal bong and petrooccipital fissure,a huge expending mass was found with clear margin.It appeared with equal and short T1,equal and long T2 signal.The signal within the mass was heterogeneous with several fluid levels.Partial enhancement in the mass could be found.Case 2.E and F indicated bony erosion in the posterior margin of the right petrous bone and vestibular aqueduct area with a quasi-circular shape.Partially it appeared honeycomb or moth-eaten corrosion.G and H showed mixed short T1 and long T2 signal in the right endolymphatic sac area.The center of the lobulated mass had long T1 and short T2 signal with remarkable enhancement.The margin of the lobulated mass had short T1 and long T2 signal.Fluid-fluid levels could be found in parts of the mass.Case 3.I and J indicated the bony erosion of the left endolymphatic sac area.K and L showed mixed T1 and long T2 signal in the left endopymphatic sac area.The flow-empty vascularization signal could be found in part of the lobulated mass.Enhancement was not remarkable.P showed enhanced CT scanning in abdomen of Case 3.A mass in the lower part of the left kidney was found.Case 4.M and N showed the CT scan of temporal bone,indicating the enlargement of endolymphatic sac notch with bony erosion.The margin of lesion was coarse.O showed the plain and enhanced CT scan of bilateral kidneys of Case 4.Renal cyst(Bosniak type II)was found on the right kidney.Q and R showed follow-up MR imaging of Case 2.The operation cavity was filled with fat tissue with no space-occupying lesion.The red arrows indicate the extension of the lesion,blue arrow heads the vestibulocochlear nerve and yellow arrows the masses in kidneys.

2.2 ELST的听力学改变

病例1以面瘫来诊，从未关注听力，所以听

术后复查纯音测听，4名患者患耳术后全聋。病例3及其家属对生活质量高度关注，积极要求尝试进行患耳人工耳蜗植入术，手术虽保留患耳耳蜗结构，但术前CT提示骨化性迷路炎可能，涉及是否可施行人工耳蜗植入术、术后效果如何等问题，尚在斟酌中。

2.3 VHL基因突变分析

在我们收集到的病例3的ELST和肾透明细胞癌肿瘤原位样本，病例3和其两子外周血，共5个样本中，我们仅在病例3的肾透明细胞癌样本中发现第3外显子发生杂合缺失c.620_633del（NM_000551.3），导 致 p.Ala207GlyfsX44（NP_000542.1）（图3）。力下降时间无法回忆。听力学检查发现左耳全聋。病例2和3均为患侧耳中度感音神经性听力下降，病例4为患侧低频轻度感音神经性听力下降（图2）。

图2 ELST的纯音测听结果。病例1左耳全聋，病例2和3均为患侧耳中度感音神经性听力下降，病例4为患侧轻度感音神经性听力下降。Fig.2 PTA of ELST cases.Complete hearing loss was found on the left ear of Case 1.Moderate sensorineural hearing loss on the involved ear was found both in Case 2 and Case 3.Mild sensorineural hearing loss was found in Case 4.

图3 在病例3的肾透明细胞癌样本中发现第3外显子发生杂合缺失 c.620_633del（NM_000551.3），导致 p.Ala207GlyfsX44（NP_000542.1）。Fig.3 In RCC tissue of Case 3,loss of heterozygosity in exon 3 in VHL gene c.620_633del（NM_000551.3）leading to p.Ala207GlyfsX44（NP_000542.1）was found.

3 讨论

ELST患者的表现因病变累及范围不同有所差异。本组病例中，病例1表现为患侧面瘫、全聋和后组颅神经受累症状，病例2、3和4则表现为单侧耳鸣，其中，病例2和3伴随中度全频感音神经性听力下降、伴或不伴典型的眩晕，病例4伴随轻度低频感音神经性听力下降（表1）。这些耳蜗和/或前庭功能障碍是常见耳科症状，容易遗漏。通过该ELST病例系列分析，建议对单侧耳鸣和听力下降患者常规检查内耳增强MR，需要排除的疾病谱中除听神经瘤外，增加ELST一项。Bausch等医生组成了国际ELST联盟，他们基于人群的登记最终获得了93名ELST患者和1789名VHL患者。在罹患VHL病的患者中ELST的患病率仅为3.6%。VHL相关的ELST的耳蜗前庭功能障碍可作为首发临床表现，ELST作为首先诊断的疾病占VHL-ELST的32%[4]。

VHL病是一种易出现内脏和中枢神经系统（Central nervous system,CNS）多器官受累的疾病，如视网膜和CNS的成血管细胞瘤（Hemangioblastoma,HB）、嗜铬细胞瘤（Pheochromocytoma,PCC）、肾细胞癌(Renal cell carcinoma,RCC)、神经内分泌胰腺肿瘤和胰腺囊腺瘤(Pancreatic neuroendocrine tumor,PNET)。目前，VHL的诊断标准是基于遗传学和临床发现两个方面。首先，临床发现包括以下几点：1.CNS HB（包括视网膜HB）；2.ELST；3.RCC；4.PCC,副神经节瘤和/或血管球瘤；5.神经内分泌肿瘤和/或胰腺多发囊肿。VHL病的诊断要满足以下组合：1.至少两个CNS HB；2.至少一个CNS HB，再加上一个上述罗列的临床发现；3.至少一个上述罗列的临床发现，再加上VHL基因的致病性突变或VHL病患者的一级亲属[6]。VHL病相关肿瘤的发生年龄和其在VHL病中的患病率见表3。目前根据基因型和表型的关联，VHL病还进一步细分为各种亚型，已在其他文献上有综述，在此不再赘述[5，6]。依据病史、家族史、临床表现及颞骨CT或MRI可以诊断ELST，但最终确诊需要病理。ELST应与颞骨原发或继发的其他疾病相鉴别：听神经瘤、外耳道耵聍腺瘤和耵聍腺癌、中耳腺瘤、中耳癌、颈静脉球体瘤和梅尼埃病等[7]。VHL病则需要与Birt-Hogg-Dube综合征、多发性的内分泌瘤、多发性副神经节瘤综合征、神经纤维瘤病、嗜铬细胞瘤、多发性囊状肾病、结节性硬化、视网膜毛细血管扩张、视网膜动脉瘤等进行鉴别[8]。

为了进一步完善临床诊断的全面性，不遗漏全身其他部位肿瘤，并对其家属进行健康教育及后续必要的监测，对于首先诊断为ELST的患者和家属有必要进行VHL基因检测和遗传咨询。在VHL基因被确认以来，已经有900多个VHL家庭被确认，发现了约200个明确的突变。突变谱包括错义突变（52%的患者）、移框突变（13%），无义突变（11%）、大的整段的缺失（11%），框内缺失或插入（6%）和剪切突变（7%）。在典型的多器官受累的符合VHL病诊断的个体中几乎能100%发现VHL基因胚系突变，但表现较为局限的VHL突变检出率迅速降到24%，只有VHL相关的肿瘤却不符合VHL诊断标准的病例中基因突变检出率低至3.3%[5]。仅在20%的ELST患者中能检测到VHL基因的胚系突变[5]。Vortmeyer等报道了一例有家族史的32岁女性患者，因VHL病（视网膜血管瘤、小脑HB和PCC）接受过治疗，后出现突发性听力下降和眩晕，诊断为ELST，序列分析显示在VHL基因的第二外显子的剪切位点有一个3核苷酸的插入突变，这是一个胚系突变[9]。苏钰等报道2例伴发中枢神经系统血管瘤的ELST患者及家系，在例1及其妹妹和母亲VHL基因第一外显子上发现c.C194G(p.S65W)突变，在例2及其母亲VHL基因第三外显子发现c.C499T(p.R167W)突变[10]。对于没有家族史的ELST散发病例，VHL基因突变的情况又如何呢？Vortmeyer等对散发的ELST的肿瘤组织进行分析发现，在4例患者中，有2例检测到VHL基因体细胞突变，其中一例是第二外显子的GA的转换（蛋白质GlyAsp），另一例是第一外显子密码子4的单核苷酸（G）缺失，导致移框；另2例则未检测到突变。通过VHL基因缺失分析未发现杂合性缺失（Loss of heterozygosity,LOH），而发现了杂合性保留（retention of heterozygosity，ROH）现 象[11]。 随 后Skalova等人对一例诊断了VHL的ELST和另一例散发的ELST进行基因分析，发现VHL-ELST患者在194发生了CT的突变，导致了氨基酸的改变S65L，和苏钰等报道的突变一致[10]。在散发ELST病例上则没有发现外显子1～3以及剪切位点的任何基因突变[12]。

表3 VHL相关肿瘤的患病率和发生年龄Table 3 Frequency andAge of Onset of VHL-Associated Tumors

在我们的病例系列中，未发现胚系突变，ELST肿瘤标本亦无阳性发现，仅在RCC标本发现了在第3外显子发生杂合缺失c.620_633del（NM_000551.3），导致 p.Ala207Glyfs*44（NP_000542.1）。这和已报道的VHL A207Cfs*49最为接近（见图4），后者可能致癌（likely oncogenic）。

图4 A207Cfs*49突变在pVHL中的位置及其3D结构（http://www.cbioportal.org/index.do?session_id=5b68ee9849 8eb8b3d56743c4,PFB 6bvb:crystal sructure of hif-2alpha-pvhl-elonginb-elonginc,Chain V:von hippel-lindau disease tumor suppressor)Fig.4 The location of A207Cfs*49 mutation in pVHL and its 3D structure.

病例3未检测到胚系突变，ELST和RCC原位肿瘤只有RCC检测到杂合突变，无法单纯用Knudson假说直接解释，或许有表观遗传学的参与[13]而导致VHL失活，或其他遗传或环境因素影响，发生Warburg效应，肿瘤细胞即使在有氧情况下也不利用线粒体氧化磷酸化产能,转而利用有氧糖酵解。尚待进一步深入研究。

目前对于VHL基因检测有很多方法，对编码区域的Sanger测序，结合缺失/重复检测是分析VHL基因的金标准，检出率达95～100%，但有嵌合体导致可能的假阴性结果。当临床表现提示非常可能发生VHL突变时，单独VHL的基因检测是合适的，如果要进行遗传学的鉴别诊断，进行遗传咨询，可以采用二代测序技术的多基因panel进行检测。因为目前基因型-表型的关系还不完全清楚，因此进行遗传咨询时也要尤为谨慎。国际上公认的是全面监测计划，美国国立卫生研究院（US National Institutes of Health,NIH）、丹麦VHL合作组织（Danish Coordination Group for VHL,DCG）以及VHL家庭联盟（VHL Family Alliance，VHLFA）都有监测指南，虽细节略有区别[6]，但总体方向是一致的。在我国尚无类似指南，可暂时借鉴国外的指南，一般每年（或2～3年）一次的全面体检，包括神经系统查体、血压检测、血液和尿液检测、视力/视网膜检查、听力检测、腹部B超和/或MR检查[5]。

在治疗方面，ELST以手术切除为主要治疗手段[10]，对于肾癌可根据情况可选择腹腔镜手术，对于晚期肾癌患者可以使用靶向药物[14]。Ding等将极光激酶A抑制剂alisertib作用在RCC细胞系上，发现VHL蛋白功能缺失的RCC细胞系有反应，而VHL野生型的细胞系则抵抗[15]。Yuan等进一步回顾性分析酪氨酸激酶抑制剂sunitinib对3名VHL病患者的疗效，一例患者在治疗后19个月PCC和RCC的肿瘤体积减小，另外两例在治疗后1年和6年的随访时间内RCC保持稳定[16]。关于ELST和VHL的临床和基础研究，有待进一步深入和转化，以期为这种多器官受累的疾病提供更全面的治疗。