5种天然植物提取物抗氧化性和酪氨酸酶抑制作用的比较

吴颖，崔彬淯，王露，税何睿智，李凯

（1.上海应用技术大学化学与环境工程学院，上海 201418）

（2.上海应用技术大学香料香精技术与工程学院，上海 201418）

目前天然美白化妆品市场日趋活跃，其产品销售与日俱增，已成为美白护肤化妆品的主流品种之一[1]。美白类产品中可使用的美白功效成分种类较多，但在市场中应用广泛的品种并不多，除熊果苷、烟酰胺、鞣花酸和Vc衍生物等美白剂外[2]，常用于商品化的天然高效美白物质更是屈指可数，如有报道光果甘草根提取物、牡丹根提取物和茶叶提取物具有高效美白功效。因此，日化行业急需开发天然安全高效的美白功效物质。美白功效物质就是作用于皮肤黑色素生成、代谢过程中抑制黑色素生成且符合规范的物质。决定人体皮肤颜色的主要因素是黑色素的含量及分布，开发美白功效物质应建立在对美白机理深入了解的基础上，而抑制皮肤黑色素是美白作用机理的中心。在黑色素合成的速率控制阶段，酪氨酸酶是其最主要限速酶[3]，通过抑制酪氨酸酶活性，可以减少黑色素的形成而达到美白的功效。因此，可通过测定酪氨酸酶活性抑制效果来作为评价物质美白效果的指标。目前，目前虽有文献报道研究天然植物提取物抑制酪氨酸酶的活性和抗氧化能力，或者植物提取物的抗氧化能力与黄酮、总酚含量[4~6]，但关于提取物对酪氨酸酶的活性作用，以及抗氧化性、黄酮和总酚含量三者间关系的研究却少有报道，也无较明确的结论。而且，文献所采用的抗氧化方法一般只涉及一种或两种，不同抗氧化方法所得的结果也不尽相同。因此，本文以桔梗、金盏菊、蒲公英、银杏叶和茶叶5种植物为研究对象，研究其对酪氨酸酶抑制作用、抗氧化能力及黄酮和总酚含量，对三者之间进行相关性分析，研究结果可为今后天然美白原料的筛选提供更多理论依据与数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桔梗、金盏菊、蒲公英、银杏叶、茶叶，上海人和堂国药总店；新鲜马铃薯，市售；硫酸亚铁、亚硝酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，国药集团化学试剂有限公司；1,1-苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）、2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、芦丁标准品、没食子酸标准品、福林试剂，上海宝曼生物科技有限公司；L-多巴、过硫酸钾、水杨酸、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、邻苯三酚、硝酸铝，上海泰坦科技股份有限公司。

1.2 仪器

722S型可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；JP-300B-6D型粉碎机，永康市久品工贸有限公司；AL204型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TDZ4A-WS型离心机，湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司。

1.3 实验方法

1.3.1 天然产物醇提物的制备

准确称取0.4 g干燥后的天然产物粉末，加入100 mL、75%（V/V）的乙醇溶液，回流提取2 h，趁热抽滤，弃去滤渣，加热浓缩定容至100 mL，则醇提物浓度为4.0 mg/mL[7]。

1.3.2 酪氨酸酶活性抑制率的测定

准确吸取醇提物1 mL，酪氨酸酶液0.5 mL，加pH=6.0的磷酸缓冲液至4 mL，于室温下静置10 min后，加入0.015 mol/L多巴溶液1 mL混匀，静置10 min后，以pH=6.0的磷酸缓冲液为参比，在475 nm处测定吸光度，以熊果苷作为对照，每个样品做3个平行样，抑制率计算公式如下：

其中，A为有酪氨酸酶但没有醇提物；B为无酪氨酸酶液也无醇提物；C为既有酪氨酸酶液也有醇提物；D为有醇提物但没有酪氨酸酶。

1.3.3 抗氧化性能检测

1.3.3.1 ABTS+清除能力的测定

参照文献[6]方法，将ABTS+溶液用磷酸缓冲液（10 mmol/L，pH 7.4）稀释，使其在734 nm波长下的吸光度为0.700±0.020，即得到ABTS+工作液。

分别取1 mL一定浓度的醇提物至试管中，加入ABTS+工作液 3 mL，充分混合均匀，室温避光保存10 min，在734 nm处测定吸光度（磷酸缓冲液为空白对照），以Vc溶液作为阳性对照，每个样品做3个平行样，清除率计算公式如下：

其中，Ai为1 mL样品溶液+3 mL ABTS+溶液的吸光度值；Aj为1 mL样品溶液+3 mL磷酸缓冲液的吸光度值；Ac为1 mL磷酸缓冲液+3 mL ABTS+溶液的吸光度值。1.3.3.2 DPPH+清除能力的测定

在2 mL 0.16 mmol/L DPPH的乙醇溶液中加入2 mL一定浓度的醇提物，混合均匀，室温下避光放置40 min，用分光光度计在517 nm波长处测定吸光度值（无水乙醇为空白对照），以Vc溶液作为阳性对照，每个样品做3个平行样，清除率计算公式如下：

其中，Ai为2 mL样品溶液+2 mL DPPH溶液的吸光度值；Aj为2 mL样品溶液+2 mL无水乙醇的吸光度值；Ac为2 mL无水乙醇+2 mL DPPH溶液的吸光度值。

1.3.3.3 羟自由基清除能力测定

在0.40 mL 6 mmol/L硫酸亚铁溶液中，加入1 mL 8.8 mmol/L的过氧化氢溶液，再加入1 mL 9 mmol/L水杨酸溶液和1.60 mL蒸馏水，混合均匀，37 ℃下水浴加热15 min（蒸馏水为空白对照），在510 nm波长下测定吸光度值 Ac。Ai为以一定浓度的醇提物代替1.60 mL蒸馏水测得的吸光度值，取1 mL蒸馏水代替过氧化氢溶液测定吸光度值为Aj。以Vc溶液作为阳性对照，每个样品做3个平行样，计算样品对羟自由基的清除率。

1.3.3.4 超氧阴离子自由基清除能力测定

向1.40 mL Tris-HCl缓冲溶液（0.05 mol/L，pH 8.2）中加入1 mL蒸馏水，再加入0.2 mL 5 mmol/L的邻苯三酚溶液，混合均匀，静置5 min后在320 nm波长处测定吸光度值Ac。

Ai为以一定浓度的醇提物代替1 mL蒸馏水测得的吸光度值，取0.2 mL 10 mmol/L盐酸溶液代替邻苯三酚溶液测定吸光度值为Aj。以Vc溶液作为阳性对照，每个样品做3个平行样，计算样品对超氧阴离子自由基的清除率[8]。

1.3.4 黄酮含量的测定

准确吸取0.2 mg/mL的芦丁标准品溶液0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 mL至试管中，加30%乙醇至5 mL，再加入5%的亚硝酸钠溶液0.3 mL，混匀静置6 min，再加入10%的硝酸铝溶液0.3 mL，混匀静置6 min，再加入4%的氢氧化钠溶液4 mL，最后加入30%乙醇0.4 mL，静置15 min。以30%乙醇为空白对照，在505 nm波长处测定吸光度值[5]。以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标建立标准曲线，得回归方程A=0.0064C+0.0189，R2=0.9997。

准确吸取一定浓度的醇提物 2 mL，按照上述方法，以30%乙醇为空白对照，在505 nm波长处测定吸光度值，根据标准曲线方程计算样品的黄酮含量，平行测定3次，取平均值。

1.3.5 总酚含量的测定

准确吸取 0.1 mg/mL的没食子酸标准品溶液0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL至试管中，加6 mL蒸馏水，摇匀，再加入0.5 mL福林试剂，混合均匀，1 min后加入1.5 mL 20%碳酸钠溶液，加蒸馏水至10 mL。反应10 min，以蒸馏水为空白对照，在760 nm波长下测定吸光度值。以没食子酸质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标建立标准曲线，得回归方程A=0.0852C+0.0089，R2=0.9984。

准确吸取一定浓度的醇提物 2 mL，按照上述方法，以蒸馏水为空白对照，在760 nm波长处测定吸光度值，根据标准曲线方程计算样品的总酚含量，平行测定3次，取平均值。

1.3.6 数据统计分析

每个样品3次重复实验，实验结果表示为平均值，数据处理采用WPS Office 2016，绘图采用Origin Pro 8。

2 结果与分析

2.1 酪氨酸酶活性抑制率的测定结果

图1 5种植物提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用Fig.1 Inhibition of tyrosinase activity by five plant extracts

按照1.3.2的实验方法，不同浓度的植物提取物对酪氨酸酶活性的抑制率变化如图1所示。

由图1可知，不同植物提取物均对酪氨酸酶有抑制作用，且随着提取物浓度逐渐增大，对酪氨酸酶的抑制率也逐渐提高，呈正相关性。其中在相同浓度范围内，茶叶提取物对酪氨酸酶的抑制率最高约为85%并已基本水平，其次为金盏菊提取物，银杏叶与蒲公英提取物对酪氨酸酶的抑制能力相当且略弱于金盏菊，桔梗提取物对酪氨酸酶的抑制率最低。

2.2 抗氧化性能检测

2.2.1 ABTS+清除能力的测定

图2 5种植物提取物对ABTS+的清除作用Fig.2 The removal of ABTS+ by five plant extracts

按照 1.3.3.1的实验方法，不同浓度的提取物对ABTS+的清除能力如图2所示。

由图2可知，不同植物提取物均对ABTS+有清除作用，且对 ABTS+的清除率与提取物浓度呈正相关性。在相同浓度范围内，茶叶提取物对ABTS+的清除率提高速度最快，其在300 µg/mL的浓度下清除率为98%并已趋于水平，其次为银杏叶与金盏菊提取物，且两者对 ABTS+的清除能力相当，蒲公英提取物对ABTS+的清除率弱于银杏叶与金盏菊提取物，桔梗提取物对ABTS+的清除率最低。

2.2.2 DPPH+清除能力的测定

图3 5种植物提取物对DPPH+的清除作用Fig.3 DPPH+ scavenging effect of five plant extracts

按照 1.3.3.2的实验方法，不同浓度的提取物对DPPH+的清除能力如图3所示。

由图3可知，在相同浓度范围内，不同种类的提取物对DPPH+的清除率的变化趋势一致，随着提取物浓度的增大而逐渐增大，其中茶叶提取物对 DPPH+的清除效果最佳，随提取物浓度的增大而增大，其在50 µg/mL的浓度下清除率为83%并已趋于水平，银杏叶、蒲公英和金盏菊次之，且三者提取物对 DPPH+的清除能力相当，桔梗的清除能力最差。

2.2.3 羟自由基清除能力测定

图4 5种植物提取物对羟自由基的清除作用Fig.4 Effect of five plant extracts on hydroxyl radical scavenging

按照1.3.3.3的实验方法，不同浓度的提取物对羟自由基的清除率如图4所示。

由图4可知，不同植物提取物均对羟自由基有清除作用，且随着提取物添加量逐渐增大，对羟自由基的清除率也逐渐提高。其中在相同浓度范围内，蒲公英提取物对羟自由基的清除率最高，金盏菊和银杏叶次之，且两者提取物对羟自由基的清除能力相当，其次为茶叶提取物，桔梗提取物对羟自由基的清除能力最差。

2.2.4 超氧阴离子自由基清除能力测定

图5 5种植物提取物对超氧阴离子自由基的清除作用Fig.5 Scavenging effects of superoxide anion radicals by five plant extracts

按照1.3.3.4的实验方法，不同浓度的提取物对超氧阴离子自由基的清除率如图5所示。

由图5可知，不同植物提取物均对超氧阴离子自由基有清除作用，且随着提取物添加量逐渐增大，对超氧阴离子自由基的清除率也逐渐提高。

在相同浓度范围内，金盏菊、蒲公英和银杏叶提取物对超氧阴离子自由基的清除率最高，且三者提取物对超氧阴离子自由基的清除能力相当，茶叶提取物次之，桔梗提取物对超氧阴离子自由基的清除能力最差。

2.3 黄酮和总酚含量的测定

按照1.3.4方法和1.3.5方法，分别测定5种植物提取物不同浓度样品的吸光度值，再根据相应的标准曲线和样品的稀释倍数，计算出5种植物中黄酮和总酚含量，结果如图6和图7所示。

图6 5种植物提取物中黄酮的含量Fig.6 Flavonoid content in five plant extracts

图7 5种植物提取物中总酚的含量Fig.7 Total phenol content in five plant extracts

由图6可知，每种植物提取物中的黄酮含量，随样品浓度的变化，其值呈波动趋势，但幅度不大，基本趋于水平，说明样品浓度不影响植物中黄酮含量的测定。

进一步比较不同植物种类间黄酮含量，从高到低顺序依次为茶叶、金盏菊、银杏叶、蒲公英、桔梗。由图7可知，每种植物提取物中的总酚含量，随着提取物浓度的增大，其值基本稳定，且不同物种间总酚含量从高到低顺序依次为茶叶、金盏菊、银杏叶、蒲公英、桔梗，与物种中黄酮含量顺序基本一致。

表1 五种植物提取物抗氧化性和酪氨酸酶抑制作用汇总Table 1 Summary of antioxidant and tyrosinase inhibition of five plant extracts

3 结果

3.1 根据相关文献报道[9]，抗氧化即为清除相关自由基，而在酪氨酸酶促进黑色素合成过程也需要有自由基的参与，但目前抗氧化能力与抑制酪氨酸酶活性之间的确切关联尚不明确，相关的文献研究报道也较少。本文以茶叶、金盏菊、银杏叶、蒲公英和桔梗为研究对象，检测其提取物对酪氨酸酶活性的影响、抗氧化性能、黄酮及总酚含量，探究抗氧化能力与抑制酪氨酸酶活性能力间的可能关联。

3.2 实验结果表明（如图1所示），在相同浓度范围内，随着植物提取物浓度增加，其植物提取物对酪氨酸酶的抑制率也逐渐增大，两者成正相关。其中茶叶提取物对酪氨酸酶的抑制率最大、已趋近于水平状态，其次为金盏菊、银杏叶、蒲公英，桔梗提取物对酪氨酸酶抑制率最低。采用4种常用抗氧化检测方法，对5种植物提取物进行抗氧化性能测定（如图2~图5），结果显示采用不同抗氧化方法所测得的抗氧化强弱顺序会有所差别，但4种抗氧化方法测定结果均表明5种植物提取物都具有一定的抗氧化性能，且提取物的浓度也与其抗氧化能力呈正相关。这一结果也提示提取物对酪氨酸酶活性的抑制率与其抗氧化作用是相关联的，这与文献报道的酪氨酸酶是多酚氧化酶，黑色素最终合成反应是由该酶催化如超氧自由基引发的过程的情况相吻合[10]。文中进一步测定5种植物提取物中的黄酮和总酚含量，图7~图8结果表明在5种植物提取物中两者含量的高低顺序基本一致，从高到低均为茶叶、金盏菊、银杏叶、蒲公英、桔梗。通常含有黄酮和总酚类的物质具有抗氧化性能，故实验采用 4种抗氧化方法都表明5种植物提取物都具有一定的抗氧化性质。

3.3 通过进一步比较分析图1、图2、图3、图6和图7的结果发现，当采用ABTS+、DPPH+方法测定时，5种植物提取物的抗氧化能力、对酪氨酸酶活性抑制作用的强弱顺序与植物中的黄酮及总酚含量高低顺序基本一致，也是茶叶的抗氧化能力和酶活抑制率最强，金盏菊、银杏叶、蒲公英为其次，桔梗最弱。由此结果推测，5种植物提取物中的黄酮和酚类物质的含量高低可能是影响其抗氧化和酶活抑制作用大小的原因。而联系黄酮、酚类物质结构，ABTS+、DPPH+方法相对于超氧自由基和羟基自由基方法来说与其抗氧化性、酪氨酸酶活抑制的相关性更大，可能是由于黄酮、酚类结构分子对酪氨酸酶的抑制类型有关，文献表明天然植物如茶叶、蒲公英中有带有酚羟基和羧基等基团的功效物质[11~15]，与酪氨酸和底物L-多巴的结构相似，能竞争地与酪氨酸酶作用，从而抑制酪氨酸酶的活性，为竞争型抑制；还有天然植物如银杏叶，其主要成分为银杏黄铜和银杏内酯，其分子结构中的还原性羟基具有孤对电子可与酪氨酸酶分子中的Cu2+络合从而影响该酶活性，为非竞争型抑制[16]。ABTS+、DPPH+两种相关性高的方法中涉及的自由基可能与天然植物对酪氨酸酶活性抑制机理有关，具体的作用机理需要后期进一步的深入研究。但本文结果提示，通过研究天然植物提取物的抗氧化性，可能会为研究或筛选具有抑制酪氨酸酶活性的天然美白原料提供一定的理论基础和依据。