三七皂苷R1对异丙肾上腺素诱导的H9c2心肌细胞肥大的保护作用

朱婷，冯玉，殷乐章,，王晓静，肖静，孙冰

（1.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所药理毒理中心，北京 100193）

（2.山东中医药大学药学院，山东济南 250355）

心肌肥厚是导致心力衰竭发生和发展的重要病理基础，是心血管疾病患者发病率和死亡率增加的一个重要原因。心肌肥厚是由多种刺激引起的多方面复杂的临床综合征，与多种病理特征有关，包括心脏收缩功能和舒张功能衰退，心肌细胞死亡，心肌炎症和心脏纤维化重塑的增加等[1,2]。研究表明，炎症反应不仅参与了心肌肥厚的发生发展过程，并且与心室重构密切相关。炎症因子在心室重构过程中起到重要作用，包括诱导心肌细胞肥大、胚胎基因表达、心肌细胞凋亡和心肌纤维化等[3]。异丙肾上腺素(isoproterenol，ISO)是一种β-肾上腺素能激动剂，特定剂量可以诱导心肌肥厚，使心肌中促炎因子如肿瘤坏死因子（TNF-α）和白介素-6（IL-6）表达增强，同时促进核转录因子-κB（NF-κB）的表达，已广泛用于建立心肌肥厚实验模型[4,5]。

三七总皂苷是人参属中药三七的主要有效活性成分[6,7]。三七皂苷R1（notoginsenoside R1），是一种从三七中分离出的主要成分和新型植物雌激素，具有抗炎，抗氧化和抗凋亡性质[8～10]。之前的研究表明，三七皂苷R1能明显抑制多种炎症因子的产生，减轻内毒素小鼠心脏功能紊乱症状[11],但其对心肌肥厚的影响少有报导。因此，本实验的主要目的为通过异丙肾上腺素刺激心肌细胞诱导心肌肥大的发生，观察三七皂苷R1对心肌细胞肥大的影响。首先，采用不同给药剂量给予三七皂苷 R1，观察不同给药剂量对 ISO诱导的心肌细胞肥大的影响。基于炎症反应在心肌肥厚发展病程中占有重要地位，本实验从组织形态学、分子生物学等多个水平，探讨三七皂苷R1对心肌肥厚及心肌炎症反应的作用，为进一步深入研究其机制提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞

H9c2心肌细胞购自中国科学院细胞库（中国上海）。

1.1.2 药品与试剂

三七皂苷R1，购自上海融禾医药科技发展有限公司，产品批号：161020；ISO，购自 Sigma公司，产品批号：16504；所有组织培养物质购自GIBCO公司；I-κBα抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司，批号为：K0711；p65、p-p65抗体购自CST公司，批号分别为：8242和3033；RT-PCR试剂盒购自鼎国昌盛生物技术有限公司，批号为：TER010-2；western试剂盒购自康维世纪生物科技有限公司，批号为：26912F；荧光测定试剂盒购自 BioVision公司，批号为：K105-100；其他试剂均为国产分析纯，水为去离子水。

1.2 方法

1.2.1 细胞模型的建立

如文献[12]所述进行培养，首先将细胞分为正常对照组，ISO（20 µg/mL）组及三七皂苷R1不同浓度（5µM，10 µM，25 µM，50 µM）给药组，测定各项指标后，选择最佳给药浓度（25 µM）进行后续实验。给药组加入选择性 NF-κB拮抗剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）预先培养30 min后加入三七皂苷R1，1 h后加入ISO，24 h后进行各项指标测定。实验共分为6组：①正常对照组；②三七皂苷R1组（25 µM）；③PDTC组；④ISO组（20 µg/mL）；⑤ISO+三七皂苷R1组；⑥ISO+三七皂苷R1+PDTC组。用以检测三七皂苷R1对NF-κB介导的抗炎和抗凋亡作用。

1.2.2 MTT法检测细胞活力

使用 3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）测定法，如上所述[12]评估细胞活力。

1.2.3 细胞表面积的测量

为了研究三七皂苷R1对ISO诱导的心肌肥大的保护作用，将细胞置于6孔板中。如上所述[12]进行培养和处理。将预处理的细胞用PBS洗涤两次，然后固定在4%多聚甲醛中。10 min后，用0.1% Triton X-10（V/V，加在PBS中）洗涤三次，除去残留的多聚甲醛。然后在1：100稀释液（含有2% BSA和0.1% Triton X-100的PBS）中加入Actin-Tracker Green。六孔板中的细胞在室温黑暗条件下培养30～60 min，0.1%Triton X-100除去过量的Actin-Tracker Green。在装有200×放大倍率数码相机的倒置显微镜下观察细胞，每孔随机捕获5张照片，并使用Image J软件测量单个细胞表面积。

1.2.4 实时定量RT-PCR法检测ANF、β-MHC、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA 表达

实时定量 RT-PCR法检测心房利钠因子(Atrial natriuretic factor，ANF)、β-肌球蛋白重链（beta-myosin heavy chain，β-MHC）、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-1β (interleukin-1 beta，IL-1β)的 mRNA 表达水平。使用Trizol试剂分离总RNA。用Prime Script RT Master Mix试剂盒合成 cDNA。使用 SYBR green premix进行实时聚合酶链反应。使用以下引物进行cDNA扩增：ANF：5'-AGCATGGGCTCCTTCTCCAT-3'(forward)和 5'-TGGCCTGGAAGCCAAAAG-3'(reverse)；β-MHC：5'-CCTACAAGTGGCTGCCTG TGT-3'(forward)和 5'-ATGGACTGATTCTCCCGAT CTG-3'(reverse)；TNF-α：5'-CATCTTCTCAAAATTC GAGTGACAA-3'(forward)和 5'-TGGGAGTAGACA AGGTACAACCC-3'(reverse)；IL-1β：5'-CAACCAAC AAGTGATATTCTCCATG-3'(forward)和5'-GATCCAC ACTCTCCAGCTGCA-3'(reverse)；IL-6：5'-GAGGAT ACCACTCCCAACAGACC-3'(forward)和5'-AAGTGC ATCATCGTTGTTCATACA-3'(reverse)；GAPDH：5'-AACGACCCCTTCATTGAC-3'（forward）和5'-TCCACGACATACTCAGCAC-3'（reverse）；使用delta delta CT方法，所有基因表达均与内参照基因（即GAPDH）的标准化相同，使用任意单位显示相对mRNA水平，并将对照组的值定义为1。实验结果由荧光定量 PCR分析软件 Applied Biosystems Primer Express Software (version 2.0)自动进行统计和计算[11]。

1.2.5 western blot法检测 I-κBα、p65、p-p65蛋白表达

如前所述[12]进行细胞裂解物制备，收集总蛋白。用BCA法蛋白定量。取等量样本上样于10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将蛋白质转移至PVDF膜上，摇床封闭 1 h，然后加入甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、NF-κBα 抑制蛋白（inhibitor of NF-κBα，I-κBα）、p65和 phosphorylation p65（p-p65）的一抗(均为 1：1000 稀释)，4 ℃过夜。次日，室温下TBST洗膜，二抗孵育1 h后洗膜，曝光显影。以GAPDH作内参，灰度分析。

1.2.6 荧光分光光度法检测Caspase-3活性

根据制造商的说明书，使用荧光测定试剂盒测定含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，caspase-3)活性。使用具有400 nm激发波长和505 nm发射波长的Fluoroskan Ascent FL荧光计读取样品的荧光强度。

1.2.7 统计学方法

2 结果与讨论

2.1 三七皂苷R1对细胞活力的影响

为了检测ISO和三七皂苷R1的细胞毒性作用，在5，10，25和50 μM三七皂苷R1作用下，将H9c2细胞与指定浓度的ISO（20 µg/mL）一起培养24 h。然后，使用MTT法检测细胞活力。

表1结果所示，随着ISO浓度（0～20 μM）的增加，细胞活力逐渐降低。而给予不同浓度三七皂苷R1（0，5，10，25和50 μM），各组之间的细胞活力没有显著差异（p＞0.05）。此外，与空白对照组相比，用ISO处理过的 H9c2细胞的细胞活力降低了约 40%（p＜0.05）。然而，三七皂苷R1以浓度依赖方式（5，10和25 μM）抑制了这种降低（p＜0.05）。值得注意地是，25 μM 三七皂苷 R1处理组细胞活力提高到约93%。然而，较高浓度（50 μM）的三七皂苷R1不能进一步提高细胞活力。

表1 三七皂苷R1对心肌细胞活力的影响Table 1 Effects of notoginsenoside R1 on the viability of cardiomyocytes(±s, n=5)

表1 三七皂苷R1对心肌细胞活力的影响Table 1 Effects of notoginsenoside R1 on the viability of cardiomyocytes(±s, n=5)

注：与对照组相比#p＜0.05；与ISO处理组相比*p ＜0.05（下同）。

组别 剂量 细胞活力/%正常对照 99.13±5.67异丙肾上腺素 0 μg/mL 99.12±7.56异丙肾上腺素 0.002 μg/mL 93.53±11.71异丙肾上腺素 0.02 μg/mL 90.10±6.82异丙肾上腺素 0.2 μg/mL 81.07±5.48#异丙肾上腺素 2 μg/mL 76.35±8.67#异丙肾上腺素 20 61.22±2.37#三七皂苷 R1 0 μM 99.30±5.33三七皂苷 R1 5 μM 98.21±6.22三七皂苷 R1 10 μM 101.87±5.28三七皂苷 R1 25 μM 101.41±6.28三七皂苷 R1 50 μM 103.93±3.98异丙肾上腺素+三七皂苷 R1 5 μM 20 μg/mL 74.64±3.14*异丙肾上腺素+三七皂苷 R1 10 μM 20 μg/mL 84.36±6.76*异丙肾上腺素+三七皂苷 R1 25 μM 20 μg/mL 92.85±4.74*异丙肾上腺素+三七皂苷 R1 50 μM 20 μg/mL 93.75±5.49*

表2 三七皂苷R1对ANF和β-MHC mRNA水平的影响Table 2 Effects of Notoginsenoside R1 on mRNA level of ANF and β-MHC(±s, n=5)

表2 三七皂苷R1对ANF和β-MHC mRNA水平的影响Table 2 Effects of Notoginsenoside R1 on mRNA level of ANF and β-MHC(±s, n=5)

组别 剂量/(μg/mL) ANF mRNA β-MHC mRNA正常对照 1.00±0.24 1.00±0.31异丙肾上腺素 20 10.89±1.58# 9.92±0.73#异丙肾上腺素+三七皂苷 R1 5 μM 20 8.91±1.33* 8.38±0.99*异丙肾上腺素+三七皂苷R1 10 μM 20 6.28±0.87* 5.45±0.87*异丙肾上腺素+三七皂苷R1 25 μM 20 5.16±0.18* 4.35±0.38*异丙肾上腺素+三七皂苷R1 50 μM 20 5.73±1.19* 4.48±0.33*

2.2 三七皂苷R1对ANF和β-MHC mRNA水平的影响

病理性心肌肥厚主要表现为心肌细胞肥大、原始胚胎基因表达增强，是心血管疾病的共同病理特征。ANP和β-MHC是重要的心肌细胞肥大标志物。ANP作为心肌细胞肥大标志物之一，在正常成年哺乳动物的心肌中几乎无表达，但在心肌肥厚动物的心肌中表达较高。因此 ANP表达量的多少，可以准确地反映心肌肥厚的程度[13]。

心肌纤维主要由肌球蛋白构成，是心肌的主要收缩蛋白，α-MHC和β-MHC作为肌球蛋白的两种表达形式分别主要存在于大鼠心室肌及胚胎期[14]。压力超负荷引起的心肌机械牵张或神经体液因子产生，使心肌细胞肥大从而上β-MHC的表达，而β-MHC的下调又可以使肌球蛋白ATP酶活性低，从而导致心脏收缩速率下降，最终导致心力衰竭[15]。因此，β-MHC也被视为心肌肥厚的分子标志。

因此本实验通过测定ANP和β-MHC以评价三七皂苷R1对心肌细胞肥大程度的影响。表2结果所示，ISO（20 µg/mL）显著增加了ANF和β-MHC的m RNA水平（p＜0.05），说明ISO（20 µg/mL）对大鼠心肌细胞已造成严重的肥大损伤；而随着三七皂苷R1浓度的升高（5，10和25 μM），这种升高作用被明显降低（p＜0.05），与模型组相比，ANF分别降低了18.18%、42.33%、52.62%；β-MHC分别降低了15.52%、45.06%、56.15%。然而，较高浓度的三七皂苷R1（50 μM）并没有进一步降低 ANF和 β-MHC的 mRNA水平（p＞0.05），与25 μM组相比，仅相差9.95%和2.9%。可能是由于25 μM已经为三七皂苷R1治疗心肌细胞肥大的最佳给药剂量。

2.3 三七皂苷R1保护心肌免受ISO诱导的肥大

形态学分析进一步研究了三七皂苷R1对ISO诱导的心肌肥大的保护作用。与对照组相比，ISO诱导后，心肌细胞表面积会增大，应用三七皂苷R1（5，10，25和50 μM）能够有效防止ISO诱导的心肌细胞肥大，与模型组相比，分别降低 18.02%、21.81%、24.50%、26.39%。然而，不同浓度的三七皂苷R1对于阻止心肌细胞表面积并没有显著差异（表3）。

表3 ISO和/或三七皂苷R1对心肌细胞大小的变化Table 3 Changes in cardiomyocyte size in response to ISO or Notoginsenoside R1(±s, n=5)

表3 ISO和/或三七皂苷R1对心肌细胞大小的变化Table 3 Changes in cardiomyocyte size in response to ISO or Notoginsenoside R1(±s, n=5)

组别 剂量/(μg/mL) 细胞面积(Arbitrary units)正常对照 99.30±5.84异丙肾上腺素 20 162.10±16.30#异丙肾上腺素+三七皂苷R1 5 μM 20 132.89±8.58*异丙肾上腺素+三七皂苷R1 10 μM 20 126.74±9.89*异丙肾上腺素+三七皂苷R1 25 μM 20 122.38±6.44*异丙肾上腺素+三七皂苷R1 50 μM 20 119.32±5.55*

2.4 三七皂苷R1对心肌细胞中ISO诱导的炎症的影响

据文献报道，心肌炎症因子表达的下调可以降低心室重塑的发生率，对心力衰竭具有保护作用[16]。炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6等）是诱发心血管疾病的常见因素之一。在病理情况下，心肌易受到各种因素刺激，生理状态下的平衡被打破，促使促炎因子大量产生、心肌肥厚及心肌纤维化产生[17]。

表4 三七皂苷R1对TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平的影响Table 4 Effects of ISO and/or Notoginsenoside R1 on the mRNA levels of TNF-α, IL-1β and IL-6(±s, n=5)

表4 三七皂苷R1对TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平的影响Table 4 Effects of ISO and/or Notoginsenoside R1 on the mRNA levels of TNF-α, IL-1β and IL-6(±s, n=5)

组别 剂量/(μg/mL) TNF-α mRNA IL-1β mRNA IL-6 mRNA正常对照 1.00±0.93 1.10±0.22 0.99±0.21异丙肾上腺素 20 19.72±2.29# 4.11±0.83# 7.70±1.12#三七皂苷R1 25 μM 1.02±0.90 1.23±0.15 1.13±0.26异丙肾上腺素+三七皂苷R1 25 μM 20 6.44±1.61* 2.82±0.62* 3.34±0.47*

另外，炎症因子的调控与NF-κB相关，NF-κB可被LPS、TNF-α等炎症因子激活，促进心室重构的发展。已有研究报道，在心肌组织中NF-κB通路的阻断在预防高血压心肌肥厚中具有良好的应用前景[18]。

因此本实验通过测定 TNF-α、IL-1β和 IL-6的mRNA水平以评价三七皂苷R1对心肌炎症因子表达影响。表4结果所示，与正常对照组相比，单独给予三七皂苷R1对TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA水平并无显著性差异（p＞0.05）。然而，细胞暴露于ISO时，各炎症因子mRNA表达水平显著增加（p＜0.05），三七皂苷R1处理后，TNF-α，IL-1β和IL-6 mRNA水平被显著抑制（p＜0.05），与模型组相比，分别降低67.34%、31.39%、56.62%，表明三七皂苷R1有效抑制心肌炎症因子mRNA水平表达，减少心肌肥厚发生。

2.5 三七皂苷R1对心肌细胞中p65磷酸化和I-κBα 的影响

NF-κB（Nuclear factor- kappa B)是一种存在于真核细胞中的转录因子，在炎症反应中发挥重要作用。据相关文献报道，NF-κB信号通路可作为心肌肥厚的潜在治疗靶点[19]。P50和p65作为NF-κB家族的两个亚单位以二聚体的形式存在于胞浆内，是其活性的主要表现形式。而作为蛋白复合体的IκB蛋白激酶通过介导IκB的激活进而活化IκB磷酸化激酶，导致IκB发生构象改变并降解，NF-κB激活并移位进入细胞核促进核因子转录[20]。

Western blot结果显示，ISO引起NF-κB p65亚基磷酸化的增加，I-κBα水平降低。相反的是，p65磷酸化和I-κBα水平的降低在25 μM三七皂苷R1预处理下明显反转（p＜0.05），与模型组相比，p65降低71.32%，I-κBα增加37.61%（图1、表5）。结果表明，ISO不仅是诱导心肌肥大导致心肌损伤的有力刺激因子，而且是I-κBα降解和p65磷酸化的炎症启动因子，促使NF-κB信号通路的激活。

图1 三七皂苷R1对心肌细胞p65、p-p65及I-κBα蛋白表达的影响Fig.1 The effects of Notoginsenoside R1 on p65, p-p65 and I-κBα in cardiomyocytes

表5 三七皂苷R1对心肌细胞p65、p-p65及I-κBα蛋白表达的影响Table 5 The effects of Notoginsenoside R1 on p65, p-p65 and I-κBα in cardiomyocytes(±s, n=5)

表5 三七皂苷R1对心肌细胞p65、p-p65及I-κBα蛋白表达的影响Table 5 The effects of Notoginsenoside R1 on p65, p-p65 and I-κBα in cardiomyocytes(±s, n=5)

组别 剂量/(μg/mL) p65 磷酸化水平(p-p65/p65) I-κBα 表达量(I-κBα/GAPDH)异丙肾上腺素 20 1.36±0.12 0.68±0.15异丙肾上腺素+三七皂苷R1 25 μM 20 0.39±0.19* 1.09±0.2*

2.6 三七皂苷R1对心肌细胞肥大的抑制作用与NF-κB信号传导有关

随着NF-κB的活化，其下游炎症因子如TNF-α，IL-6和IL-1β的水平升高。在这些炎症因子中，TNF-α一方面通过促进 IL-6等的表达进一步促使炎症的发生，另一方面激活Caspase诱导的凋亡促进心肌重塑的发生[21]。

将H9c2细胞用PDTC（NF-κB的特异性抑制剂）处理30 min，给予三七皂苷R1（25 μM）1 h，然后用ISO（20 µg/mL）处理 24 h。

如表6所示，与空白对照组相比，ISO显著提高了ANF mRNA的水平（p＜0.05）。给予三七皂苷R1后，这种升高会被显著降低（p＜0.05），与模型组相比，ANF降低55.04%；在PDTC共同处理下，这种抑制又被显著反转（p＜0.05），与模型+给药组相比，ANF升高22.46%。与三七皂苷R1对ANF活性的抑制作用相似，三七皂苷R1显著抑制ISO诱导的Caspase-3的表达（p＜0.05），与模型组相比，Caspase-3降低47.37%；而与PDTC共同处理时，这种抑制又会被显著反转（p＜0.05），与模型+给药组相比，Caspase-3升高 34.46%。另外，单独用三七皂苷 R1对 ANF和Caspase-3的表达没有显著影响（p＞0.05）。这些数据表明，三七皂苷R1对ISO诱导的心肌肥大的抑制作用与NF-κB的抑制密切相关。

表6 三七皂苷R1对心肌细胞肥大的影响与NF-κB信号传导有关Table 6 The effects of Notoginsenoside R1 on hypertrophy in cardiomyocytes is associated with NF-κB signalling

3 结论

3.1 本文在成功制备 ISO致心肌细胞肥大模型的基础上，探究了三七皂苷R1对大鼠H9c2细胞心肌肥大的保护作用，结果显示：三七皂苷R1各剂量组自身对心肌细胞活力并无明显差异，但给予ISO处理后，三七皂苷R1各剂量组明显抑制了ISO所致的细胞活力的降低，并显著降低ISO所致的ANF和β-MHC的m RNA表达水平，心肌细胞表面积统计结果也显示三七皂苷R1有明显的改善心肌细胞肥大的作用。

3.2 在上述研究结果基础上，从炎症方面探究了三七皂苷R1对大鼠H9c2心肌细胞的保护作用。结果表明，ISO不仅是诱导心肌肥大导致心肌损伤的有力刺激因子，而且是I-κBα降解和p65磷酸化的炎症启动因子，促使NF-κB信号通路的激活。数据还显示，随着NF-κB的活化，其下游炎症因子如TNF-α，IL-6和IL-1β的水平升高。在这些炎症因子中，TNF-α的上调可以直接导致细胞凋亡，如通过心肌细胞中 Caspase-3的激活所证实。此外，与三七皂苷R1类似，NF-κB抑制剂PDTC也部分抑制了ISO诱导的ANF mRNA的表达。同时，PDTC抑制了 ISO诱导的心肌细胞中Caspase-3的活化。因此，三七皂苷R1可以通过阻断NF-κB信号通路来保护心肌细胞以免ISO诱导的心肌肥大。

3.3 总之，本研究表明，三七皂苷R1预处理能改善细胞存活力，降低心肌细胞面积，减弱ISO引起的炎性细胞因子的产生，抑制心肌细胞中NF-κB的活化。虽然三七皂苷R1预处理显著抑制了ISO诱导的心肌功能障碍和心肌细胞中的炎症因子表达，但是三七皂苷R1对心肌肥厚的治疗作用的研究尚不完善。因此，需要进行更全面的研究来验证三七皂苷R1治疗心肌肥大的病理机制，为其进一步临床应用提供理论基础。