HPLC法测定壮药白饭树中岩白菜素含量

*

1.广西国际壮医医院，广西 南宁 53001；2.广西医科大学药学院，广西 南宁 530022

白饭树来源于大戟科植物Flueggea virosa(Roxb.ex Willd.)Voigt.的干燥全株，为壮族民间常用药材[1-3]，多以全株入药，认为其苦、微涩，凉，有小毒，具有清热毒、除湿毒之功，用于能唅能累(湿疹)，头疮，呗脓显(脓包疮)，呗脓(痈肿)，发旺(痹病)。白饭树在广西分布于全区各地。文献记载，从白饭树的树叶及嫩枝中分离出岩白菜素、右旋一叶萩碱 、山柰酚、槲皮素、没食子酸、胡萝卜苷和β-谷甾醇等[4-5]。其中，岩白菜素具有良好的镇咳和治疗胃肠道疾病如胃溃疡、腹泻及便秘的作用以及良好的抗炎、抗心律失常、抗病毒、护肝作用，是本品活性成分之一[6-9]。实验以岩白菜素为指标成分，建立高效液相色谱法测定白饭树药材中岩白菜素含量，用于白饭树药材的质量控制，为《广西壮族自治区壮药质量标准(第三卷)》收录白饭树药材的质量标准研究奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 1260型高效液相色谱仪(带自动进样器及VWD检测器，安捷伦公司)；LC-20AT高效液相色谱仪(自动进样器、二极管阵列检测器，岛津公司)；UV-2401PC紫外-可见分光光度计(岛津公司)；KQ-3200DE型数控超声波清洗器(昆明市超声仪器有限公司)；XS205十万分之一电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；EASYPURE Ⅱ超纯水器(美国热电公司)。

1.2 材料 岩白菜素对照品(批号：111532-201203，纯度94.4%，中国食品药品检定研究院供)。甲醇、乙腈为色谱纯(德国merck公司)，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。白饭树药材采自广西15个不同产地，来源信息见表1。其中，BFS-1和BFS-8药材采集了对应带果腊叶标本，经广西中医药研究院赖茂祥研究员和广西中医药大学韦松基教授鉴定，均为大戟科植物白饭树Flueggea virosa(Roxb.ex Willd.)Voigt。

表1 白饭树样品来源信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为依利特SinoChrom ODS-BP(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇-水(15∶85)，流速1.0 mL/min，柱温25℃，检测波长275 nm。

2.2 供试品溶液制备方法的筛选

2.2.1 提取方法的考察 取BFS-2粉末，分别比较超声和加热回流两种提取方法制备的供试液岩白菜素含量。方法为取样品粉末约0.5 g，精密称定，各精密加入甲醇25 mL，密塞，称定重量后，超声处理30 min，放冷，用甲醇补足减少的重量，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；方法与上述类似，但超声处理改为水浴加热回流。分别精密吸取上述供试品溶液和对照品溶液5 mL进样测定岩白菜素含量。结果，上述两种提取方法制备的供试品溶液岩白菜素含量相同(均为0.68%)。从操作简便考虑，选择超声提取的方法。

2.2.2 供试品溶液制备方法的条件优化 采用正交设计方法，对超声提取的药材破碎度、甲醇浓度、提取时间等三因素三水平进行考察，见表2。以岩白菜素的含量为考核指标，采用L9(34)正交设计表安排试验，结果见3和表4。

表2 正交试验因素水平表

表3 正交试验与结果

表4 方差分析

注:F0.05(2，2)=19，F0.01(2，2)=99

由表2和表3可知，影响岩白菜素得率的因素大小顺序为：药材破碎度>甲醇浓度>提取时间，药材破碎度对实验结果影响有一般显著性差异，其余因素对实验结果影响无显著性差异。综合考虑，确定最佳提取条件为A3B1C1。

2.3 对照品、供试品和阴性溶液制备 取岩白菜素对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度为60 μg/mL的溶液，作为对照品溶液；取本品粉末(过四号筛)约0.5 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞,称定重量, 超声处理(功率150 W，频率40 KHZ)30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。以甲醇溶液作为阴性对照溶液。

2.4 专属性试验 取上述三种溶液各5 mL，照2.1项条件进样测定。结果：供试品溶液的色谱图中均有与岩白菜素保留时间相同的吸收峰，阴性溶液的色谱图则无此吸收峰。说明用本方法测定岩白菜素含量无阴性干扰，专属性强。见图1。

2.5 线性关系考察 精密称取岩白菜素对照品16.1 mg(纯度为94.4%)，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。分别精密吸取以上对照品溶液0.15、1、2、3、4、5 mL分别置于5 mL量瓶中，各加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为不同浓度的对照品溶液。分别精密吸取上述对照品稀释溶液各5 mL，照2.1项色谱条件进样测定，以对照品的进样量(μg)为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线。结果：岩白菜素进样量在0.045 6-1.519 μg范围内，进样量与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y=1543.1X-8.003 7(r=0.999 9)。

2.6 精密度试验

2.6.1 重复性 取同一份供试品溶液(BFS-2)，照2.1项色谱条件连续进样测定6次。结果：6次测定岩白菜素峰面积分别为910.1、902.1、903.1、897.5、899.4、894.6，平均值为901.1，RSD=0.60%(n=6)。

2.6.2 重现性 取白饭树药材(BFS-2)粉末(过四号筛)约0.5 g，精密称定，照2.3.1项方法平行制备6份供试品溶液，照2.1项色谱条件进样测定。结果：6份供试品溶液测得岩白菜素含量分别为0.68%、0.68%、0.68%、0.70%、0.70%、0.69%，平均值为0.69%，RSD=2.04%(n=6)。

2.7 稳定性试验 取白饭树药材同一供试品溶液(BFS-2)，分别于0、2、4、6、12和24 h各进样测定。结果：24 h内6次测得的岩白菜素含量分别为0.66%、0.67%、0.68%、0.67%、0.67%、0.67%，平均值为0.67%，RSD为1.19%(n=6)。

2.8 加样回收率试验 分别精密称取已知含量的样品粉末(BFS-2)0.25 g共6份，精密称定，各加入岩白菜素对照品的甲醇溶液(72.8 μg/mL)25 mL，照2.2项方法制备供试品溶液，并照2.1项色谱条件测定岩白菜素含量，计算平均回收率及RSD。结果：岩白菜素含量平均回收率为102.6%，RSD=2.09% (n=6)。见表5。

表5 加样回收率试验结果 (n=6)

2.9 仪器最低检出限 取岩白菜素对照品甲醇溶液进行稀释，计算信噪比S/N=3及信噪比S/N=10时注入仪器的量。结果：岩白菜素对照品的最低检出限为0.9 ng，最低定量限度为2.28 ng。

2.10 耐用性试验 分别采用依利特SinoChrom ODS-BP、Aglient 5 TC C18柱和Phenomenex Gmini C18(规格均为4.6 mm×250 mm，5 μm)3根不同品牌色谱柱，测定样品(BFS-2)中岩白菜素的含量。结果：3根色谱柱测定岩白菜素平均值为0.60%，RSD=1.73%(n=3)；分别采用安捷伦1260型和岛津LC-20AT 2台不同品牌的色谱仪，测定样品(BFS-2)中岩白菜素含量。结果：2台色谱仪测定岩白菜素平均值为0.61%，RAD=0.91% (n=2)。表明不同品牌色谱柱和不同品牌高效液相色谱仪对本法测定结果影响不大。

2.11 样品测定 取上述1.2项岩白菜素对照品和15批药材样品，照2.2项方法制备对照品溶液和供试品溶液，照2.1项色谱条件测定，按药材干燥品计算含量。结果：15批样品岩白菜素含量为0.096%～1.43%。结果见表6。

表6 15批白饭树中岩白菜素含量测定结果 (n=2)

3 讨论

3.1 色谱柱的选择 在其它色谱条件相同的情况下，分别采用依利特SinoChrom ODS-BP、Aglien 5 TC C18和Phenomenex Gemini C18(规格均为4.6 mm×250 mm，5 μm)三根色谱柱测定样品(1号)。结果上述三根色谱柱均可得到良好的分离效果。本文选择依利特SinoChrom ODS-BP作为色谱柱。

3.2 流动相的选择 在其它色谱条件相同的情况下，对甲醇-水(15∶85)、甲醇-水(18∶82)以及乙腈-水(15∶85)三个流动相系统，以及0.8 mL/min、1.0 mL/min和1.2 mL/min三个流速进行考察，结果：甲醇-水(15∶85)的流动相系统分离效果较好，三种流速岩白菜素均可得到良好的分离效果，本文选用1.0 mL/min的流速。

3.3 波长选择 采用岛津UV-2401PC紫外-可见分光光度计对岩白菜素色谱峰在200～600 nm范围内进行紫外光谱扫描。岩白菜素在210 nm、275 nm波长有较大吸收，因实验过程中流动相的甲醇在220 nm波长时有干扰，故确定检测波长为275 nm。

3.4 实验过程中，比较过甲醇和乙醇两种不同溶剂提取白饭树中岩白菜素得率，结果用乙醇提取的样品注入色谱仪测定后，色谱分离效果不佳，故最终采用甲醇提取法。

综上，本法测定白饭树中岩白菜素的含量，样品提取方式简单，且无其他成分干扰；方法学研究表明，该测定方法稳定，重现性好，准确度高，分离度好，为白饭树药材的质量控制提供了科学依据。目前，本含量测定方法已收入《广西壮族自治区壮药质量标准(第三卷)》“白饭树”项下，作为该药材生产、流通、使用和检验的依据。