桂科猪主要免疫指标测定与初步分析

苏乾莲 梁家幸 李斌 周英宁 陈忠伟 谢炳坤 闭炳芬 秦毅斌 卢冰霞 何颖 段群棚 卢敬专 蒋冬福 潘天彪 赵武*

(1，广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室 530001；2，广西畜牧研究所530001)

桂科猪是由广西畜牧研究所利用广西优良本地品种陆川猪作为母本与杜洛克作为父本培育出来的一个新的配套系猪种，兼具本地猪肉质鲜美和外来猪生长速度快双重优点[1]。机体抗病力一般受先天免疫和后天免疫所协调。先天性免疫快速，无特异性，是防御的第一线，主要与嗜中性细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、补体、干扰素和急性蛋白因子有关。后天性免疫涉及到淋巴细胞 (如T细胞、B细胞)，通过独特的遗传机理产生特殊的抗原反应。二者通过直接与细胞接触或通过包括化学介质、细胞因子和趋化因子相互作用[2]。细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，是机体内特异高效调控免疫细胞和协调免疫应答最重要的信号分子，可髙效调节免疫反应、炎性反应、组织修复、移植排斥反应和造血功能等，并且在各类具有免疫活性细胞的分化、发育、成熟和活化中起着十分重要的控制作用[3]。

Th细胞主要分为Th1和Th2两个亚类，通过产生不同类型的细胞因子，达到Th1/Th2平衡[4]。Th1细胞迁移入感染位点并分泌细胞因子IFN-γ、IL-2和TNF-β，促进细胞介导的免疫应答并可抵御病毒等胞内病原体。Th2细胞促进体液免疫应答，其刺激B细胞增殖、抗体分泌及抗体类别转换为IgE和IgA，它们分泌IL-4、IL-5、IL-10和IL-13[5]。白细胞介素-2（IL-2）又称T淋巴细胞生长因子（TCGF)，在分裂素或特异性抗原刺激作用下，主要由活化的辅助性T淋巴细胞（CD4+和CD8+)分泌产生，还可由T细胞瘤细胞和一些前T细胞、前B细胞产生，甚至自然杀伤性细胞（NK)和淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK)也可产生[6]。白细胞介素-4（IL-4）是由抗原或有丝分裂原诱导Th2细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞等产生的特征性细胞因子[7]。白细胞介素-10（IL-10）是Th2细胞产生的一种细胞因子，主要是抑制Th1细胞的分泌，也可刺激效应B细胞的增殖分化，并且能产生抗体，具有双向调节作用[8]。 γ-干扰素（IFN-γ)是由病毒或其他干扰素（IFN)诱生剂刺激使人或动物活化的T细胞和NK细胞产生的一类高活性、多功能的生物活性糖蛋白，属于Th1型细胞因子，具有较强的免疫调节活性，对细胞免疫和体液免疫具有放大作用[9]。IL-2等免疫指标可作为抗病育种的间接指标，通过评估免疫指标是选育提高动物抗病性的一条有效、可行的途径[10]。本试验以桂科猪作为试验对象，对其主要免疫指标进行测定与初步分析，试验结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 试剂盒及疫苗

Procine IL-2 ELISA KIT 96T、Procine IL-4 ELISA KIT 96T、Procine IL-10 ELISA KIT 96T、Procine IFN-γ ELISA KIT 96T均购自上海研晶生物科技有限公司，Classical Swine Fever Virus Antibody Test Kit购自美国IDEXX公司。猪瘟活疫苗（传代细胞源）购自中牧实业有限公司。

1.2 试验动物

本次试验采用广西畜牧研究所桂科猪育种场提供的2014年10月1日出生的19头健康桂科育成猪和2014年10月9日出生的22头健康桂科育成猪，体重在35～60kg，对猪群进行连续7次采血，7周龄开始，每周1次直至13周龄。

1.3 血样采集

采血前禁食12h，记录猪只性别、编号、免疫情况。前腔静脉采集血液3ml放入无抗凝剂的离心管中，并标记相应的编号，直接送回本实验室制备血清。

1.4 细胞因子测定

血清中IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ含量采用ELISA法进行测定，按试剂盒说明书进行操作。

1.5 抗体检测

根据猪瘟疫苗二免时间每批猪选择5个时间点的血清，用IDEXX猪瘟病毒抗体检测试剂盒对桂科猪血清中的特异性猪瘟病毒抗体进行检测。

1.6 统计分析作图

原始数据用Excel进行初步分析，采用SPSS19.0版进行单因素方差分析，用Duncan's法进行显著性检验，用Pearson方法进行相关性分析。用Graphpad软件对阻断值做图并分析猪瘟抗体消长规律。

2 结果

2.1 细胞因子测定结果

由表1显示，IL-2在第10周与第1周差异显著（p＜0.05），第11、12、13周分别与第7、8、9、10周差异极显著（P＜0.01）；IL-4在第8、11周分别与第9周差异显著（p＜0.05），第12、13周分别与第8、11周差异显著（p＜0.05），第7、12、13周分别与第9、10周差异极显著（p＜0.01），第8、11周分别与第10周差异极显著（p＜0.01）；IL-10在第12周分别与第11、13周差异显著（p＜0.05），分别与第7、8、9、10周差异极显著（p＜0.01），第11、13周分别与第8周差异显著（p＜0.05），分别与第7、9、10周差异极显著（p＜0.01）；IFN-γ在第12周与第11周差异显著（p＜0.05），分别与第7、8、9、10周差异极显著（p＜0.01），第13周分别与第9、10周差异显著（p＜0.05）。

图1 IL2+IFN-γ/IL-4+IL-10比值变化曲线

表1 细胞因子测定结果（单位：ng/L）

表2 不同免疫指标不同时间段相关性分析结果

2.2 免疫指标测定结果分析

由表2可知，7～10周，血清中IFN-γ与IL-2呈极显著负相关（p＜0.01），与IL-4呈极显著正相关（p＜0.01）；IL-4与IL-2呈极显著负相关（p＜0.01）。10～12周，IL-4与IL-2呈显著正相关（p＜0.05）；IL-10与IL-2呈显著正相关（p＜0.05），与IL-4呈极显著正相关（p＜0.01）。12～13周，IFN-γ 与IL-2呈极显著正相关（p＜0.01），与IL-4呈极显著负相关（p＜0.01），与IL-10呈极显著正相关（p＜0.01）；IL-4与IL-2呈极显著负相关（p＜0.01）；IL-10与IL-2呈极显著正相关（p＜0.01），与IL-4呈极显著负相关（p＜0.01）。由图1可知，IL2+IFN-γ与IL-4+IL-10的比值在约第10周龄达最小值，在约第13周龄恢复到原来比值。

2.3 猪瘟抗体检测结果分析

两批猪猪瘟疫苗首免时间皆为22日龄，加强免疫时，第一批猪在70日龄进行，第二批猪在62日龄进行，两批猪加强免疫后猪瘟抗体水平皆比首免后第一次采样血清中的抗体水平有一定程度的提高。样本阻断率与抗体水平呈正相关，猪瘟抗体消长趋势如图2和图3。

3 讨论

图2 第一批桂科猪猪瘟抗体消长趋势

图3 第二批桂科猪猪瘟抗体消长趋势

IL-2能维持和促进T细胞和B细胞增殖与分化，增强单核细胞和NK细胞的杀伤活性，诱导淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK)和γ-干扰素的产生及多种细胞因子受体表达，还可以增加抗原递呈细胞表面MHCI类分子和MHCII类分子的数量，增强抗原递呈作用，促进免疫球蛋白（IgM和IgG)的分泌[6]。IL-4具有重要的免疫功能，可增强B细胞和T细胞的相互作用，促进体液免疫应答，尤其是IgE的分泌，还可诱导单核-巨噬细胞表达MHCII类分子，增强其抗原递呈能力，改善造血细胞的增殖与分化，诱导CD4+Th幼稚前体细胞定向分化为Th2型细胞，抑制Thl细胞产生细胞因子，是Th2细胞分泌的自我调节生长因子，对肿瘤细胞具有细胞毒作用[7]。IL-4可以抑制NK细胞黏附于内皮细胞，并抑制其进一步聚集和活化、抑制蜕膜NK细胞表达IL-2受体，从而阻断NK细胞活性及其对滋养层的损伤[11]。IL-10能抑制Th1细胞源性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ 和 Th2细胞源性细胞因子IL-4、IL-5的产生，还能通过抑制T淋巴细胞产生IFN-γ、IL-2直接影响T细胞的分化和增殖，但IL-10能提高抗凋亡蛋白BCL-2的表达，促进B细胞表面高亲和力IL-2受体过表达[12]。IFN-γ具有广谱抗病毒活性，可诱导机体产生多种抗病毒蛋白，对多种病毒均有抑制作用，能够增强NK细胞、K细胞的杀伤活性，增强组织相容抗原和某些受体的表达，还能增强巨噬细胞的杀伤和吞噬能力，促进巨噬细胞的细胞毒活性，抑制病毒在新感染细胞内的复制，还可通过刺激抗原递呈细胞表达MHCⅠ类分子和MHCⅡ类分子增强机体的获得性免疫反应，利于向杀伤性T细胞递呈抗原，引起靶细胞的溶解，通过特异性CTL加速病毒的清除[9]。

本试验结果显示IL-2在第10周分别与11、12、13周差异极显著（P＜0.01），与第1周差异显著（p＜0.05）；IL-4在第10周分别与7、8、11、12、13周差异极显著（p＜0.01）；IL-10在第10周分别与11、12、13周差异极显著（p＜0.01）；IFN-γ在第10周与第11周差异极显著（p＜0.01），与第13周差异显著（p＜0.05）。注射猪瘟疫苗后对Th1/Th2有直接的影响，IL2+IFN-γ/IL-4+IL-10比值在约第10周龄达最小值，注射疫苗两周后达最高并很快恢复到原来比值。7～13周，血清中IL-2经历了先减少后增加的变化，IL-4经历了先增加后减少的变化，IL-10、IFN-γ经历了不同程度的先增加后减少再增加的变化，彼此间的相关性也处在动态变化中。IFN-γ与IL-2的相关性从极显著负相关（p＜0.01）到无显著相关再到极显著正相关（p＜0.01）；IFN-γ与IL-4的相关性从极显著正相关（p＜0.01）到无显著相关再到极显著负相关（p＜0.01）；IFN-γ与IL-10的相关性从无显著相关到极显著正相关（p＜0.01）。IL-4与IL-2由极显著负相关（p＜0.01）到显著正相关（p＜0.05）再到极显著负相关（p＜0.01）。注射猪瘟疫苗会影响细胞因子分泌和特异性抗体的产生，调节Th1/Th2平衡。

4 结论

综上结果表明，桂科猪这一新的配套系猪种有良好的免疫系统和免疫功能，本试验数据可以为开发有特色的商品猪生产模式疫病防控提供科学依据。