点阵微针射频对鲜红斑痣动物模型鸡冠作用的实验研究

孙丽华，刘丽红，李万水，张 歆，杨蓉娅

鲜红斑痣(port wine stains，PWS)是一种发生在真皮浅层的先天性毛细血管扩张畸形，发病率为0.3%～0.5%。出生时皮损呈粉红色斑片，未经治疗的皮损，通常随着年龄的增长，颜色逐渐加深，皮损渐增厚形成斑块或结节状，不仅影响皮肤的正常生理功能，还会对患者心理健康带来伤害。脉冲染料激光（pulsed dye laser，PDL）治疗PWS已30多年，一直被认为是PWS治疗的“金标准”。但是，大量的临床研究表明，仅10%～15%PWS患者经过多次PDL治疗后皮损能得到彻底地清除，有20%～30%的患者出现对PDL治疗抵抗[1]。因此，临床上需要不断地发展新的设备代替或辅助传统的激光来治疗PDL抵抗型或增厚型PWS，以增加皮损的清除率。

点阵微针射频（fractionated microneedle radiofrequency，FMRF）是利用矩阵式排列的微针，刺破表皮层，可控地到达真皮层或皮下脂肪层，针尖发射射频对组织进行加热，有效避免了表皮的热损伤。临床上，FMRF主要应用于面部松弛、皱纹、毛孔粗大、痤疮萎缩性瘢痕、腋臭及膨胀纹的治疗[2-4]。笔者应用FMRF治疗面部年轻化和痤疮凹陷性瘢痕时，发现患者面部的毛细血管扩张和痤疮后遗红斑均得到改善甚至完全消退，说明射频能量对毛细血管扩张有一定的治疗作用，文献报道也有类似的结果[5]。因此，推测FMRF可能适用于PWS的治疗，由于其治疗深度在皮下0.5～5 mm可调，尤其适用于增厚型PWS的治疗。本实验选用雄性莱亨鸡鸡冠为动物模型，通过观察FMRF干预鸡冠后血管数量变化及Ⅰ型/Ⅲ型胶原比例变化情况，为FMRF临床治疗PWS提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

清洁级雄性莱亨鸡30只（北京梅里亚维通实验动物技术有限公司）；盐酸赛拉嗪注射液（吉林省华牧动物保健品有限公司）；Ⅰ型胶原兔抗人多克隆抗体和Ⅲ型胶原兔抗人多克隆抗体（武汉博士德生物工程公司）；Bodytite射频治疗仪（以色列InvasixLtd公司）装有一个手柄和一次性治疗头，治疗头参数：5×5根近端绝缘的32-G微针电极，进针深度是1～3 mm，发射射频的针尖长度 是0.6 mm；Image-pro Plus 6.0图像分析软件。

1.2 方法

FMRF治疗参数包括：能量、脉宽、进针深度，FMRF进针深度为1.5 mm，将能量和脉宽分别设定低、中、高3个级别得到治疗参数组合如下：治疗组（10 W/1 000 ms/1.5 mm、10 W/1 500 ms/1.5 mm、10 W/2 000 ms/1.5 mm、16 W/1 000 ms/1.5 mm、16 W/1 500 ms/1.5 mm、16 W/2 000 ms/1.5 mm、20 W/1 000 ms/1.5 mm、20 W/1 500 ms/1.5 mm、20 W/2 000 ms/1.5 mm）和空针组（0 W/1 000 ms/1.5 mm、0 W/1 500 ms/1.5 mm、0 W/2 000 ms/1.5 mm），空白组（不做任何处理），每组参数组合随机在6只动物鸡冠上进行处理。 处理前予盐酸赛拉嗪注射液，0.1 ml/kg，肌内注射对实验动物进行麻醉。鸡冠一侧用甲紫笔标记实验区域，其对侧鸡冠不做任何处理，作为自身对照。用0.1%苯扎溴铵溶液消毒，随后对每个实验区域予FMRF处理。干预后实验动物相同条件下饲养28 d。分别在干预后的第14、28天对实验动物麻醉后，用微型环钻分别钻取各个实验区域全层鸡冠组织，实验侧的对侧鸡冠组织为其自身对照。10%甲醛溶液固定，行组织病理切片行苏木精-伊红（HE）染色及免疫组化染色。

1.2.1 一般情况 观察并记录各组鸡冠在干预前、干预后即刻、第3天、7天、14天、28天的大体形态学变化，摄相并存档。

1.2.2 HE染色 干预后第14天、28天，光学显微镜下观察，并拍照保存记录。每张切片随机选择5个高倍视野进行血管计数（10×40），计算出毛细血管平均数，毛细血管减少率=（自身对照侧毛细血管平均数－实验侧毛细血管平均数）/自身对照侧毛细血管平均数×100%，计算出各组鸡冠的毛细血管减少率。

1.2.3 免疫组化染色 取鸡冠组织蜡块切片，分别行Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维免疫组化染色。采用Image-pro Plus 6.0图像分析软件进行分析，每个标本随机选取5个视野，软件分析阳性染色面积和总面积，分别计算出阳性百分比，即Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原所占的面积百分比。Ⅰ型/Ⅲ型胶原比例=Ⅰ型胶原面积百分比/Ⅲ型胶原面积百分比。

1.3 统计学方法

采用SPSS21.0统计软件包进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni检验，干预后14 d和28 d时间上的差异采用重复测量的方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

观察期内实验动物一般情况良好，无动物死亡。FMRF干预后即刻，治疗组及空针组实验区域均出现红斑、水肿及点状渗血。干预后第3天，治疗组红斑、水肿减轻，出现点状结痂（图1a）；空针组红斑、水肿完全消退（图1b）。干预后第7天，治疗组红斑、水肿基本消退，实验区颜色轻度发白，矩阵式排列的点状结痂明显（图1c）；空针组实验区域恢复正常鲜红色（图1d）。干预后第14天，治疗组恢复正常鲜红色，痂皮逐渐脱落；空针组痂皮完全脱落，创面愈合。干预后第28天，治疗组和空针组实验区域鸡冠均恢复正常颜色 。各组鸡冠均未出现萎缩及瘢痕形成。

2.2 HE染色观察

干预后第14天，治疗组实验侧鸡冠组织真皮乳头层毛细血管数量减少、血管管径变小，管腔内红细胞减少，少量胶原纤维增生。干预后第28天，治疗组实验侧鸡冠真皮乳头层毛细血管数量明显减少、血管管径变小，部分血管闭锁，胶原纤维增生明显。空针组及各组自身对照组织病理比较无明显变化，表皮大致正常，真皮乳头层可见大量扩张的毛细血管、管腔较大（图2）。

图1 FMRF干预后3 d、7 d鸡冠大体形态观察

图2 FMRF干预后28 d鸡冠组织病理（HE×400）

2.3 毛细血管减少率

FMRF干预后第14天，所有治疗组鸡冠毛细血管减少率与空针组鸡冠毛细血管减少率比较差异有统计学意义（P＜0.001）。治疗组之间两两比较，10 W/1 000 ms/1.5 mm与16 W/2 000 ms/1.5 mm有显著差异（P=0.024）；10 W/1 000 ms/1.5 mm与20 W/1 500 ms/1.5 mm有显著差异（P=0.008）；10 W/1 000 ms/1.5 mm与20 W/2 000 ms/1.5 mm有显著差异（P＜0.001）；10 W/1 500 ms/1.5 mm与20 W/2 000 ms/1.5 mm有显著差异（P=0.007）；16 W/1 000 ms/1.5 mm与20 W/2 000 ms/1.5 mm有显著差异（P=0.002）；其他治疗组之间及空针组之间两两比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 FMRF干预后第28天，各组毛细血管减少率见表1。采用重复测量的方差分析对FMRF干预后14 d及28 d的血管减少率结果进行检验，不同时间测量的血管减少率有统计学差异，F=11.767，P=0.001，即FMRF干预鸡冠后28 d血管减少率较14 d时的血管减少率差异有统计学意义，血管的数量进一步的减少。

2.4 免疫组化染色

FMRF干预鸡冠后28 d，各组鸡冠Ⅰ型/Ⅲ型胶原比例通过单因素方差分析比较有显著性差异，P＜0.001。通过两两比较，空白组、空针组、10 W/1 000 ms/1.5 mm、10 W/1 500 ms/1.5 mm、10 W/2 000 ms/1.5 mm、16 W/1 000 ms/1.5 mm、16 W/1 500 ms/1.5 mm之间无显著性差异；但与16 W/2 000 ms/1.5 mm、20 W/1 000 ms/1.5 mm、20 W/1 500 ms/1.5 mm、20 W/2 000 ms/1.5 mm 4组比较差异均有统计学意义 ，P＜0.001（表2）。

表1 FMRF干预后14 d、28 d各组毛细血管减少率（±s，%）

表1 FMRF干预后14 d、28 d各组毛细血管减少率（±s，%）

组 别 14 d 28 d 0 W/1 000 ms/1.5 mm 0.83±2.99 2.50±1.05 0 W/1 500 ms/1.5 mm -2.83±1.17 0.67±3.88 0 W/2 000 ms/1.5 mm -2.00±6.07 -1.17±3.71 10 W/1 000 ms/1.5 mm 52.33±5.82 52.83±6.88 10 W/1 500 ms/1.5 mm 57.33±7.26 58.83±6.56 10 W/2 000 ms/1.5 mm 62.67±6.15 61.50±4.04 16 W/1 000 ms/1.5 mm 56.00±8.58 60.33±9.87 16 W/1 500 ms/1.5 mm 62.50±6.03 65.83±10.05 16 W/2 000 ms/1.5 mm 66.17±6.91 69.00±8.30 20 W/1 000 ms/1.5 mm 60.50±6.16 65.17±5.74 20 W/1 500 ms/1.5 mm 67.33±5.96 68.50±3.51 20 W/2 000 ms/1.5 mm 72.50±8.87 75.67±6.98

表2 FMRF干预后28 d各组Ⅰ/Ⅲ型胶原纤维比值（±s）

表2 FMRF干预后28 d各组Ⅰ/Ⅲ型胶原纤维比值（±s）

组 别 28 d空白组 0.93±0.01 0 W/1 000 ms/1.5 mm 0.90±0.02 0 W/1 500 ms/1.5 mm 0.91±0.02 0 W/2 000 ms/1.5 mm 0.94±0.03 10 W/1 000 ms/1.5 mm 0.91±0.03 10 W/1 500 ms/1.5 mm 0.93±0.03 10 W/2 000 ms/1.5 mm 0.94±0.04 16 W/1 000 ms/1.5 mm 0.93±0.02 16 W/1 500 ms/1.5 mm 0.96±0.02 16 W/2 000 ms/1.5 mm 1.05±0.03 20 W/1 000 ms/1.5 mm 1.04±0.03 20 W/1 500 ms/1.5 mm 1.14±0.05 20 W/2 000 ms/1.5 mm 1.12±0.04

3 讨论

FMRF是近几年新兴的一种治疗方法，通过微针电极将射频能量直接传递到目标组织部位，能量大小、作用时间和进针深度均可控制，相对于传统的点阵激光，不仅保护了表皮不受损伤，还避免靶色基位置和能量被吸收的不确定性[6]。Min等[5]应用FMRF治疗痤疮后红斑，皮损组织病理检查发现血管减少，免疫组化染色可见皮肤组织中VEGF染色强度减弱，故推断FMRF具有抗不正常的血管增生作用。

本实验采用FMRF干预鸡冠后第14天和28天对鸡冠行组织病理学检查，见治疗组真皮乳头层毛细血管数量明显减少，血管管径变小，部分血管管腔闭锁，而空针组及对侧未处理的自身对照组鸡冠血管数量未见减少，血管管腔扩张明显。通过Bonferroni检验两两比较，所有治疗组鸡冠的毛细血管减少率与空针组的毛细血管减少率比较差异均有统计学意义。说明FMRF干预PWS动物模型雄性莱亨鸡鸡冠后，可有效减少鸡冠真皮层毛细血管的数量。治疗组之间两两比较，并不是所有低、中、高能量/脉宽之间差异均有统计学意义，低能量/低脉宽组与高能量/高脉宽组的毛细血管减少率差异有统计学意义。各治疗组的毛细血管减少率是随着能量和脉宽的增加，呈增加的趋势，提示FMRF对鸡冠组织血管的损伤强度随着射频能量和脉宽的增大而增强，这对今后临床应用FMRF治疗血管性疾病治疗参数的选择具有一定的指导意义。

胶原是细胞外基质的最主要的成分，在创伤的修复及维持皮肤的张力和弹性中起到至关重要的作用。在创伤愈合早期，胶原纤维排列疏松，主要以Ⅲ型胶原为代表，它的特点是维持组织的柔韧度，即决定了组织修复后的弹性。在创伤愈合的后期，Ⅲ型胶原逐渐被吸收，Ⅰ型胶原分泌增加，它有利于创面的收缩紧致并增强组织的表面张力，从而增加伤口的抗拉伸强度[7]。组织在创伤修复的早、中、晚期，Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原处于一个动态变化的过程，但正常的损伤修复，恢复后期都会产生一个相对稳定的Ⅰ型/Ⅲ型胶原比值。因此，本实验观察了修复后期，即FMRF干预后第28天，鸡冠组织的Ⅰ型/Ⅲ型胶原的比值，结果提示，在一定的射频能量和脉宽范围内，鸡冠修复后均能保持稳定的Ⅰ型/Ⅲ型胶原比例，与空白组及空针组比较无显著性差异。但是，当FMRF的能量/脉宽＞16 W/2 000 ms时，Ⅰ型/Ⅲ型胶原比例开始出现增高，提示治疗能量过大可能会造成鸡冠组织出现纤维化的风险。

既往已有应用射频（radiofrequency，RF）治疗血管性疾病的报道[8,9]。RF可以使小的血管完全封闭，对于管径较粗的血管也可实现血管直径缩小，部分血流限制，是一种非常有应用前景的血管封闭治疗手段。本实验通过观察FMRF干预动物模型鸡冠，得出RF可以有效地减少鸡冠毛细血管数量，鸡冠组织大体观察未见萎缩及瘢痕形成，证实了FMRF应用于治疗PWS患者的有效性和安全性。相对传统激光治疗PWS，FMRF治疗的优势有以下3点：①靶色基，RF热作用产生主要取决于组织的阻抗，即RF波作用于组织的水分子，使双极水分子发生振动，通过高速旋转摩擦产生热量；而激光是通过选择性光热作用原理产生热量，对于深肤色人群，激光治疗发生不良反应的风险增加。②表皮的保护，FMRF是通过矩阵式排列的微针将RF能量直接输送到需要治疗的靶组织位置，而接触表皮处的针体不发射RF，不会对表皮造成热损伤；而激光需透过表皮才能到达目标部位，因此，多需要另配冷却装置来避免表皮的热损伤。③治疗的深度，FMRF作用深度可以根据皮损的深度、厚度进行调控；而激光作用深度与其波长相关，理论上波长越长，穿透越深。由于激光的穿透性和吸收特性，往往决定了穿透深度和血红蛋白对其选择性吸收的强度不能同时兼顾。因此，FMRF可作为PWS的联合治疗手段，给临床上PDL抵抗型或增厚型PWS患者带来新的希望。