30%土霉素注射液制备工艺的研究

李双江，刘聚祥

(河北农业大学动物医学院，河北保定 071000)

土霉素(oxytetracycline，OTC)属于四环素类广谱抗生素，通过抑制细菌肽链的增长，影响蛋白质的合成而达到抑菌杀菌效果[1]，同时也对附红细胞体、支原体立克次氏体及血液原虫和梨形虫等感染有特殊功效[2]。临床上一般使用土霉素的盐酸盐，即盐酸土霉素，盐酸土霉素呈淡黄色粉末状，按照土霉素的传统用法口服给药，不仅给药剂量大，扰乱正常的肠道菌群，造成各种副作用，而且由于病畜的吸收不完全、排泄物等造成严重的环境污染[3-4]。

土霉素注射液最早是由美国辉瑞制药公司开发研制。近年来，农业部也审批了10%和20%两种规格的土霉素注射液，但在考察实际应用中，还存在诸多问题[5]。在低温环境下，土霉素注射液的黏稠度高，使实际生产环节中过滤灭菌工艺无法顺利进行，并且在临床使用时不宜注射。而在高温条件下，注射液中有效成分不稳定，盐酸土霉素容易发生开环裂解，活性成分遭到不可逆的破坏。另外，国内的土霉素注射液还存在有效含量低的问题，导致药物的作用时间短，需要多次注射和大量给药，引起动物应激，造成较大的经济损失等问题。我国的产品采用的有机溶媒多为甘油缩甲醛、吡咯烷酮、二甲基乙酰胺等，这些有机溶剂价格高昂，相关产品稳定性低，在实际生产中性价比低，这也是直接导致我国土霉素注射液产品缺乏市场竞争力的原因[6]。为改善我国土霉素注射液产品质量，本试验旨在开发30%的土霉素注射液，减少多次注射行为造成的动物应激，筛选出更经济更稳定的注射溶媒，提高注射液品质；并且加入缓释剂，在注射部位形成凝胶库，延长药物的作用时间，提高生物利用度，增强药效，减少毒副作用[7]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用药 土霉素标准品，中国兽医药品监察所产品；盐酸土霉素，河北健民淀粉糖业有限公司产品；二甲基甲酰胺、聚乙二醇200、六水合氯化镁，天津市福晨化学试剂厂产品；聚乙烯吡咯烷酮-K17，青岛优索化学科技有限公司产品；甲醛合次硫酸氢钠，天津市光复精细化工研究所产品；注射用水，河北农业大学动物医学院药理实验室自制。

1.1.2 主要仪器设备 HJ-4A数显恒温磁力搅拌器，金坛市医疗仪器厂产品；Sartorius AG-T214型电子天平、Sartorius PB-21酸度计，北京德国赛多利斯仪器系统有限公司产品；高效液相色谱，日本岛津公司产品。

1.2 方法

1.2.1 土霉素注射液中有效含量的测定

1.2.1.1 液相检测方法参数 高效液相色谱仪系统由日本岛津液相色谱仪、岛津SPD-20A紫外检测器、C18的sunfire色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)组成。流动相A为乙腈，流动相B为0.01 moL/L的三氟乙酸溶液，双泵等度洗脱。洗脱条件为：35%的A流动相，65%的B流动相，流速为1 mL/min，检测波长为350 nm，进样量为20 μL，运行时间为10 min。

1.2.1.2 标准品储备液和供试品储备液的配置 电子天平称取土霉素标准品0.001 g(精确到0.000 1位)，用甲醇定容到1 mL，并且充分溶解，得到1 mg/mL的标准品储备液。同样的方法用土霉素原料药制备相同浓度的供试品储备液，两者放于冰箱置-4℃保存备用。

1.2.1.3 标准曲线的建立 将标准品储备液配成1 000、2 000、5 000、10 000、20 000、50 000 ng/mL浓度待测液。用高效液相色谱法进行测定，测定顺序由低到高依次进行，并记录不同浓度下的峰面积，根据浓度和对应的峰面积，建立标准曲线。应用标准曲线，建立外标法，用于土霉素注射液浓度的检测。

1.2.1.4 回收率的计算 将供试品储备液，用流动相溶液稀释为2 000、5 000、10 000 ng/mL浓度的待测液，通过检测不同浓度下的峰面积，并记录结果，计算得出质量浓度和回收率[8]。

1.2.2 土霉素注射液有机溶媒的筛选 通过预试验，比较多种有机溶剂的溶解力和价格。筛选出二甲基甲酰胺和聚乙二醇200两种有机溶剂。为确定二者最佳浓度比例，进行了以下试验。首先，将4个10 mL的透明西林瓶编号为1、2、3、4，并在每个瓶中加入500 μL的注射用水，加入相同剂量的络合剂六水合氯化镁和氧化剂甲醛合次硫酸氢钠，在常温下充分搅拌溶解。之后，将二甲基甲酰胺和聚乙二醇200按照如下梯度剂量：1.5 mL∶1.5 mL；2 mL∶1 mL；2.5 mL∶0.5 mL；3 mL∶0 mL，在10 mL的离心管中混合，配制成不同比例浓度的复合有机溶媒。将混合后的复合有机溶媒依次倒入编号1、2、3、4的西林瓶中。最后每个样品中分别加入相同剂量的聚乙烯吡咯烷酮和1.5 g的盐酸土霉素，充分浸润，在相同的温度下，转速为1 000 r/min，搅拌溶解。待溶液充分溶解后，降至至室温，加入乙醇胺调节pH至8.0～9.0。灌装后煮沸30 min。在自然条件下存放30 d。通过对比所制土霉素注射液加速试验前后的颜色、通透性、pH及注射液中有效成分的浓度变化来筛选最佳复合有机溶媒。

1.2.3 土霉素注射液制备工艺 根据制剂中各种成分的溶解性差异，以及土霉素高温易氧化的特点，设计以下2种制备工艺：

工艺1：将六水合氯化镁和甲醛合次硫酸氢钠与处方量的注射用水溶解，为A液；在45℃的条件下，将处方量聚乙烯吡咯烷酮K17和土霉素原料药与有机溶媒混合溶解，为B液；将A液和B液充分搅拌混合。温度降至室温后乙醇胺调节pH至8.0～9.0。过滤灭菌，氮气覆盖灌装。

工艺2：将处方量的注射用水置于锥形瓶中，首先加入六水合氯化镁和甲醛合次硫酸氢钠，常温搅拌溶解，后加入处方量的有机溶媒和聚乙烯吡咯烷酮K17，充分混匀溶解，接着加入盐酸土霉素，充入氮气，在45℃的条件下，充分搅拌溶解。温度降至室温后乙醇胺调节pH至8.0～9.0。过滤灭菌，氮气覆盖灌装。

1.2.4 土霉素注射液组方筛选 通过1.2.2的试验中已经筛选出土霉素注射液中最优的有机复合溶媒，并通过预试验，确定土霉素注射液使用的稳定络合剂为六水合氯化镁，抗氧化剂为甲醛合次硫酸氢钠，缓释剂为聚乙烯吡咯烷酮K17，以及确定各个成分的范围。为了进一步确定土霉素注射液中这3个用量，通过SPSS设计一个三因素三水平的正交试验，如表1所示。并按照1.2.3中的工艺2的方法来制备土霉素注射液。以制备前后土霉素的有效含量的变化为考察因素，来讨论并确定土霉素注射液的最佳配方。

表1 正交试验表L9(33)

2 结果

2.1 样品检测方法的确定

土霉素注射液在加标样品处能有效分离出峰(图1)。并且空白对照(图2)与样品检测无干扰，显示该方法专属性良好。

根据不同浓度下，土霉素注射液的峰面积绘制的土霉素的标准曲线如图3所示。其中x表示土霉素在相应条件下的峰面积，y表示相对应的质量浓度。并根据计算得出标准曲线方程y=0.026 6x+575.45，R2=0.999 6。试验得出土霉素注射液在该检测方法下，在1 000 ng/mL～50 000 ng/mL范围内线性关系良好。

图1 土霉素标准液色谱图

图2 土霉素注射液空白对照图

图3 盐酸土霉素的标准曲线

3个不同浓度下的供试品储备液的回收率试验结果如表2所示。结果为平均回收率为98.99%，标准偏差为2.35，变异系数为0.02%。显示该方法土霉素回收率极高，专一性良好。可以用作土霉素注射液有效含量的检测。

2.2 土霉素注射液有机溶媒的确定

在使用4个不同比例复合有机溶媒制作的土霉素注射液，经过相同的处理，静置1个月后，各项指标检测结果如表3所示。

表2 盐酸土霉素回收率试验结果

表3 不同比例有机溶媒中各项检测指标结果

根据试验结果显示，土霉素在4种不同比例复合溶媒下的颜色、澄明度、流动性及稳定性得出，土霉素注射液随二甲基甲酰胺的比例增加，土霉素注射液的稳定性也逐步升高。从图4中可得出，4个组溶媒中，第4组经过加速试验后，有效成分浓度最高。最终，选择纯二甲基甲酰胺作为土霉素注射液的溶媒，放弃聚乙二醇200。

2.3 土霉素注射液最佳配方的确定

根据表1，得出正交试验结果为表4，由极差(R)大小可以确定，C

2.4 制备工艺的确定

根据试验得出的最佳配方，使用工艺1和工艺2同时制备3批注射液，比较2种工艺下土霉素制剂的外观和有效成分浓度，结果如表5。并通过spss进行独立样本t检验，结果见表6。

图4 不同比例有机溶媒下盐酸土霉素的质量浓度变化

序号№因素 FactorsABC含量/%Content changes13315.3022333.3432122.3243222.6751110.5362210.9473130.9881321.9591232.65K15.133.836.77K26.606.626.94K38.9510.596.97K11.711.282.26K22.202.212.31K32.983.532.32R1.272.250.06

注：A为甲醛贺辞硫酸氢钠，B为六水合氯化镁，C为聚乙烯吡咯烷酮K17。各因素的水平用量均参照表1添加。

Note：A. Sodium formaldehyde sulfoxylate;B.Magnesium chloride hexahydrate;C.Polyvinylpyrrolidone K17.The level of each factor is added with reference to Table 1.

表5 两种工艺制备土霉素注射液外观及含量

表6 以含量为指标进行独立样本t检验分析结果

3 讨论

《中国兽药典》(2015版)收录的标准溶剂为α吡咯烷酮，但是该溶剂溶解度低，黏度高，在实际生产中，多用于20%土霉素制剂的溶解，并且所制产品稳定性差。专利号为CN1156963A的土霉素注射液，利用甘油缩甲醛、聚乙二醇、氧化镁等开发出一种土霉素浓度为30%的组合物，但该组合物在低温下，虽然稳定性良好，黏稠度却高，而在高温下显示出较差的稳定性。通过大量筛选有机试剂，优选出二甲基甲酰胺作为有机溶媒。二甲基甲酰胺简称DMF，溶解力强，与水可以任意比例互溶，被称为“万能溶剂”[9]。二甲基甲酰胺应用于强力霉素、维生素B6、地塞米松和磺胺嘧啶等多种药物的有机溶剂，此外，还应用于肾上腺素、喹啉以及氨磺酰的优良溶剂[10]。该试剂作为溶媒制成的30%的土霉素注射液与其他溶媒相比较，表现出良好的流动性，并且生产成本降低[11]。

3.1 添加工艺的选择

在工艺方面，通过比较2种工艺所制的土霉素注射液，外观上两组制剂无肉眼可见差异，通过检测有效成分浓度变化不显著(P>0.05)。工艺2与工艺1相比较，生产环节更简单省力，有效节约资源，故选择工艺2。

3.2 组方的确定

土霉素在溶液中呈游离状态，非常容易发生差向异构反应、水解反应、氧化反应和脱水反应，并且高温、酸性或碱性条件会加速这些反应[12]。我国要求的土霉素注射液的pH范围在8.0～9.0之间。为提高制剂的稳定性，本试验采用六水合氯化镁为络合剂，确定了含量为30%的土霉素注射液的使用的六水合氯化镁为11%。

在本产品中加入的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是一种绿色高分子产品。聚乙烯吡咯烷酮具有优异的溶解性、低毒性、化学稳定性、黏结能力等[13]。在医药工业中是一种良好的医药缓释剂和药物崩解剂[14]。土霉素注射液中应用相对分子量较小的聚乙烯吡咯烷酮 K17，一方面降低了注射液的黏稠度，另一方面在注射液注入动物肌肉时，能在注射部位，形成凝胶，使药物缓慢释放，增加药物作用时间，还能降低过高的血药浓度对动物机体造成的毒副作用[15-18]。

最终根据试验结果得出制备30%土霉素注射液的组方和工艺如下：六水合氯化镁11%，甲醛合次硫酸氢钠0.8%，注射用水5%，二甲基甲酰胺60%，5%聚乙烯吡咯烷酮K17，30%盐酸土霉素。

添加工艺为：将注射用水置于锥形瓶中，首先加入六水合氯化镁和甲醛合次硫酸氢钠，常温搅拌溶解，后加入处方量的有机溶媒和聚乙烯吡咯烷酮K17，充分混匀溶解，接着加入盐酸土霉素，充分搅拌溶解。

本试验开发的30%土霉素注射液，组方合理，添加工艺可行，用料来源广泛，价格经济，具有良好的市场应用前景。