肝龙胶囊联合水飞蓟宾对肝纤维化大鼠肝组织Col-Ⅰ和TIMP-1基因表达的影响

邵明园，赖 泳

(1.大理大学药学与化学学院，云南大理 671000；2.大理大学药学与化学学院/云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理 671000)

肝纤维化是各种慢性肝病发展过程中引起的肝脏内包括胶原蛋白等细胞外基质(extracellular matrix，ECM)沉积和降解失衡的一种伤口愈合反应，是肝硬化、肝癌和肝功能衰竭形成的必经阶段，严重危害人类的健康[1-3]。研究表明，肝纤维化发生和发展的中心环节是肝星状细胞的增殖和活化，肝星状细胞是产生ECM的重要细胞，肝纤维化及早期肝硬化是可逆的[1,4]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)能特异性降解ECM，MMPs能与基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)结合形成复合物，从而抑制MMPs的活性。因此，提高MMPs的活性或抑制TIMPs的表达，可促进ECM的降解并抑制肝纤维化[5-7]。目前，还没有特效药可以治疗肝纤维化。肝龙胶囊的主要成分是美洲大蠊提取物，肝龙胶囊和水飞蓟宾都具有抗肝炎、保肝的作用[8-11]。本课题组前期研究发现，肝龙胶囊合用水飞蓟宾能显著降低人肝星状细胞中Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)和基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)mRNA的表达，且可以增强水飞蓟宾的抗肝纤维化作用。本研究采用猪血清诱导大鼠肝纤维化，旨在探讨肝龙胶囊联合水飞蓟宾对肝纤维化大鼠肝组织中Col-Ⅰ和TIMP-1 m RNA的表达影响，为临床评价肝龙胶囊联合水飞蓟宾治疗肝纤维化提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性SD大鼠72只，体重180 g±200g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证：SCXK(湘)2011-0003。

1.1.2 药物及试剂 水飞蓟宾胶囊(批号16041601)，天津天士力圣特制药有限公司产品；肝龙胶囊(批号550706087)，昆明赛诺制药有限公司产品；猪血清(批号20210922)，北京燕生政博生物科技有限责任公司产品；焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC，批号729b028)，北京索莱宝科技有限公司产品；Trizol(批号49164)，北京普博斯生物科技有限公司产品产品；SYBR Green Bestar®qPCR Mastermix(批号P-2020938)，上海星汉生物科技有限公司产品；6×Loading burffer(批号A6601A)，日本TakaRa公司产品；M-MLV Reverse Transcriptase OMEGA (Cat:TQ2401-01)、10×mmol/L dNTP mix(批号00322735)、RiboLock RNase Inhibitor(批号00327353)，美国Thermo Scientific公司产品；DNA Marker D 2 000(批号H7104)，北京天根生化科技有限公司产品；Biowest琼脂糖(批号111760)，北京基因科技有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 2720型PCR扩增仪，美国ABI公司产品；G：BOX 凝胶成像系统，英国Syngene公司产品；DYY-6C型电泳仪，北京市六一仪器厂产品；Smart Spec Plus型核酸蛋白测定仪、CFX96TMreal-time Systerm，美国Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 肝纤维化模型复制和标本收集 将72只雄性SD健康成年大鼠适应性饲养1周后，完全随机分为正常组、模型组、水飞蓟宾组、肝龙胶囊低剂量组、肝龙胶囊中剂量组、肝龙胶囊高剂量组、水飞蓟宾+肝龙胶囊低剂量组、水飞蓟宾+肝龙胶囊中剂量组、水飞蓟宾+肝龙胶囊高剂量组，每组8只。正常组给予9 g/L生理盐水，其余组均给予未灭活猪血清腹腔注射，每次0.5 mL/只，2次/周，连续10周；于第11周灌胃给药，正常组和模型组给予等量的蒸馏水，其余组给予相应剂量的药物。水飞蓟宾胶囊剂量，7 mg/kg，3次/d；肝龙胶囊低剂量，120 mg/kg，2次/d；肝龙胶囊中剂量，60 mg/kg，2次/d；肝龙胶囊高剂量，30 mg/kg，2次/d；所有给药容量为0.5 mL/100 g。于16周末处死大鼠，取大鼠肝组织保存于-80℃备用。

1.2.2 Real-time PCR方法检测肝组织Col-Ⅰ、TIMP-1 mRNA的表达

1.2.2.1 总RNA抽提 取冻存的大鼠肝组织约50 mg，加入1 mL的Trizol，在冰浴状态下匀浆，至无肉眼可见组织，按Trizol试剂说明书操作步骤提取总RNA。以20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，核酸蛋白测定仪测定各个RNA样本的纯度和浓度，OD260/OD280在1.8～2.0之间表示合格。提取的总RNA置于-20℃保存备用。

1.2.2.2 总RNA逆转录 按照RevertAidTM M-MuLv逆转录酶说明书操作，取1 μg总RNA以1 μL OD 18为引物进行逆转录，将合成好的cDNA置于-20℃保存备用。

1.2.2.3 引物设计与合成 根据GenBank中Col-Ⅰ、TIMP-1和β-actin(做内参)设计引物：Col-Ⅰ引物序列号为：NM-053304.1，上游引物序列为：5′-CAGTCGATTCACCTACAGCACG-3′，下游引物序列为：5′-GGGATGGAGGGAGTTTACACG-3′，扩增产物长度为201 bp；TIMP-1引物序列号为：NM-053819.1，上游引物序列为：5′-GATATGTCCACAAGTCCCAGAACC-3′，下游引物序列为：5′-CCACAGCCAGCACTATAGGTCTTT-3′，扩增产物长度为163 bp；内参β-actin引物序列号为：NM-031144.3，上游引物序列：5′-GTCACCAACTGGGACGATA-3′，下游引物序列：5′-GAGGCATACAGGGACAACA-3′，产物长度201 bp。所有引物均由通用生物系统(安徽)有限公司合成。

1.2.2.4 PCR测序 随机抽取样本进行RT-PCR反应，得到的产物取5 μL于20 g/L的琼脂糖凝胶电泳，并将产物进行PCR测序。

1.2.2.5 实时荧光定量PCR扩增和产物验证 使用CFX96 real-time PCR Detection System进行PCR扩增及结果分析，采用SYBR法。取逆转录的cDNA 2 μL为模板，配制反应体系：10 μL Bestar®SybrGreen qPCR mastermix，前后引物各0.5 μL，灭菌双蒸水为8 μL。反应条件为：95℃ 2 min，95℃ 10 s，55℃ 30 s(β-actin退火温度为46℃)，共40个循环。扩增完成后进行溶解曲线分析，95℃ 5 s,65℃ 5 s，每个循环增加0.5℃。可得到扩增曲线、融解曲线和待测基因的相对表达量。结果采用比较CT法定量，计算方法为：2-ΔΔCT法。根据2-ΔΔCT值计算Col-Ⅰ、TIMP-1及β-actin基因的起始模板量，从而反映出Col-Ⅰ、TIMP-1在不同样本中的表达水平。

2 结果

2.1 总RNA的完整性检测

提取的总RAN上样于20 g/L的琼脂糖凝胶电泳，结果可以看到28 S、18 S、5 S RNA条带，说明RNA完整性好；且28 S和18 S的亮度比约为2∶1，表明RNA无降解(图1)。

2.2 实时荧光定量PCR溶解曲线

将RNA逆转录后进行实时荧光定量PCR检测，通过对实时荧光定量PCR融解曲线分析，可以看到单一的峰型，说明扩增产物有较高的特异性(图2)。

1，2.空白组；3.模型组；4.水飞蓟宾组；5.肝龙胶囊低剂量组；6.肝龙胶囊中剂量组；7.肝龙胶囊高剂量组；8.水飞蓟宾+肝龙胶囊低剂量组；9.水飞蓟宾+肝龙胶囊中剂量组；10.水飞蓟宾+肝龙胶囊高剂量组

1,2.Control group; 3.Model group; 4.Silibinin group; 5.Ganlong capsule low dose group; 6.Ganlong capsule middle dose group; 7.Ganlong capsule high dose group; 8.Silibinin+Ganlong capsule low dose group; 9.Silibinin+Ganlong capsule middle dose group; 10.Silibinin+Ganlong capsule high dose group

图1肝组织RNA琼脂糖凝胶电泳

Fig.1 Agarose gel electrophoresis of liver tissue RNA

A.Ⅰ型胶原；B.基质金属蛋白酶抑制剂1；C.β-肌动蛋白A.Col-Ⅰ；B.TIMP-1；C.β-actin

2.3 PCR测序结果

将纯化后的RT-PCR产物进行测序反应，Col-Ⅰ测序结果与GenBank(Gene ID：29393)上公布的序列一致；TIMP-1测序结果与GenBank(Gene ID：116510)上公布的序列一致；β-actin测序结果与GenBank(Gene ID：81822)上公布的序列一致，测序结果如图3(截取部分)。

2.4 肝龙胶囊联用水飞蓟宾对肝纤维化大鼠肝组织Col-Ⅰ mRNA的表达影响

大鼠肝组织中Col-Ⅰ mRNA表达结果显示，与空白组相比，模型组、肝龙胶囊低剂量组、肝龙胶囊高剂量组、水飞蓟宾+肝龙胶囊低剂量组、水飞蓟宾+肝龙胶囊中剂量组均能增加Col-Ⅰ mRNA的表达，分别增加了4.08、0.13、1.46、0.31、15.54倍(P<0.05)；水飞蓟宾组、肝龙胶囊中剂量组、水飞蓟宾+肝龙胶囊高剂量组能降低Col-Ⅰ mRNA的表达，分别降低了0.36、0.65、0.25倍(P<0.05)。与模型组相比较，水飞蓟宾组、肝龙胶囊低、中、高剂量组、水飞蓟宾+肝龙胶囊低剂量组、水飞蓟宾+肝龙胶囊高剂量组均能显著降低大鼠肝组织中Col-Ⅰ mRNA的表达，分别降低了4.44、3.95、4.73、2.62、3.77、4.33倍(P<0.05)。水飞蓟宾和肝龙胶囊都能降低Col-Ⅰ mRNA的相对表达量；肝龙胶囊联用水飞蓟宾对Col-Ⅰ mRNA的相对表达量呈现低、高浓度抑制，中浓度促进的作用(表1)。

2.5 肝龙胶囊联用水飞蓟宾对肝纤维化大鼠肝组织TIMP-1 mRNA的表达影响

实时荧光定量PCR结果显示，与空白组比较，水飞蓟宾组、肝龙胶囊中剂量组和肝龙胶囊高剂量组对TIMP-1 mRNA的相对表达量分别降低了0.62、0.49、0.35倍(P<0.05)；与模型组相比，水飞蓟宾组、肝龙胶囊低、中、高剂量组、水飞蓟宾+肝龙胶囊低、高剂量组均能降低肝纤维化大鼠肝组织TIMP-1 mRNA的表达，分别降低了15.73、15.09、15.6、15.46、14.02、15.05倍(P<0.05)；肝龙胶囊对TIMP-1 mRNA的相对表达量呈现中、高浓度抑制，低浓度促进的作用；肝龙胶囊联用水飞蓟宾对TIMP-1 mRNA的相对表达呈现低、高浓度抑制，中浓度促进的作用(表2)。

3 讨论

肝纤维化是指由于各种慢性肝病导致肝细胞结构和功能改变，肝脏内ECM过度沉积的病理过程。肝纤维化是可逆的，若不及时治疗，持续发展可引起肝硬化和肝细胞癌。因此，获得有效的治疗方法及有效药物显得极为重要，成功复制肝纤维化动物模型是研究肝纤维化的前提。由于猪血清作为异种血清，在机体中可产生免疫复合物进而发生一系列变态反应，诱导的免疫性肝纤维化与人类肝炎中肝纤维化发生存在一定相似之处，并且对肝细胞无损伤，较四氯化碳法所致肝纤维化模型稳定，造模时间长，动物存活率高，因此本试验采用猪血清法诱导大鼠肝纤维化[12-14]。

A.Ⅰ型胶原；B.基质金属蛋白酶抑制剂1；C.β-肌动蛋白A.Col-Ⅰ ；B.TIMP-1；C.β-actin

组别Group剂量/(mg·kg-1)DoseⅠ型胶原 mRNA(2-ΔΔCT)Col-Ⅰ mRNA(2-ΔΔCT)空白组 Control group-1.00±0.153,6)模型组 Model group-5.08±2.031,6)水飞蓟宾组 Silibinin group70.64±0.082,4)肝龙胶囊低剂量组 Ganlong capsule low dose group301.13±1.646)肝龙胶囊中剂量组 Ganlong capsule middle dose group600.35±0.193,6)肝龙胶囊高剂量组 Ganlong capsule high dose group1202.46±0.922,4)水飞蓟宾+肝龙胶囊低剂量组 Silibinin+Ganlong capsule low dose group7+301.31±0.264,5)水飞蓟宾+肝龙胶囊中剂量组 Silibinin+Ganlong capsule middle dose group7+6016.54±1.244)水飞蓟宾+肝龙胶囊高剂量组 Silibinin+Ganlong capsule high dose group7+1200.75±0.661,4)

注：1)P<0.05，2)P<0.01 vs空白组；3)P<0.05，4)P<0.01 vs模型组；5)P<0.05，6)P<0.01 vs水飞蓟宾组。

Note：1)P<0.05，2)P<0.01 vs control group；3)P<0.05，4)P<0.01 vs model group；5)P<0.05，6)P<0.01 vs silibinin group.

表2 肝龙胶囊联用水飞蓟宾对肝纤维化大鼠肝组织TIMP-1 mRNA的表达影响±s，n=8)

注：1)P<0.05，2)P<0.01 vs空白组；3)P<0.05，4)P<0.01 vs模型组；5)P<0.05，6)P<0.01 vs水飞蓟宾组。

Note：1)P<0.05，2)P<0.01 vs control group；3)P<0.05，4)P<0.01 vs model group；5)P<0.05，6)P<0.01 vs silibinin group.

肝纤维化时，肝星状细胞被激活，合成大量ECM，ECM的主要成分是Col-Ⅰ和Ⅲ型胶原。ECM的沉积和降解与MMPs和TIMPs有关，MMPs能降解ECM，而TIMPs能与MMPs以1∶1结合为复合物而抑制MMPs的活性。研究发现，MMP-1 主要降解 Col-Ⅰ和Ⅲ型胶原，MMP-13则主要降解Col-Ⅰ；而TIMP-1主要能抑制MMP-1和MMP-13的活性，所以降低TIMP-1的表达可以抑制肝纤维化的发展[14-16]。

本研究结果表明，大鼠肝纤维化时Col-Ⅰ和TIMP-1 mRNA表达均升高，给予水飞蓟宾治疗后，Col-Ⅰ和TIMP-1 mRNA表达水平均显著降低；给予肝龙胶囊治疗后，只有肝龙胶囊中剂量组能显著降低Col-Ⅰ和TIMP-1 mRNA表达水平；两者联合治疗时，水飞蓟宾联合肝龙胶囊低、高剂量组能降低Col-Ⅰ和TIMP-1 mRNA的表达。此结果提示：水飞蓟宾能通过下调Col-Ⅰ、TIMP-1 mRNA的表达，发挥抗肝纤维化的作用；肝龙胶囊中剂量组对大鼠肝纤维化有显著抑制作用；水飞蓟宾联合肝龙胶囊作用于免疫性肝纤维化大鼠时，水飞蓟宾联合肝龙胶囊中剂量组能明显增加Col-Ⅰ和TIMP-1 mRNA的表达，其可能原因为：①肝龙胶囊的化学成分复杂，主要有信息素、氨基酸、昆虫神经肽、糖类、蛋白质、油脂、核酸类、异黄酮[17-18]等，由此进入机体后进行生物转化，转化的产物促进ECM沉积，增加TIMP-1的合成，促进肝纤维化；②肝纤维化病理因素及病理过程复杂，肝龙胶囊和水飞蓟宾作为中药，作用于肝纤维化存在多层次多靶点的作用。