发光细菌毒性检测机理及应用研究进展

胡欣颖 贺稚非 李洪军

(1. 西南大学食品科学学院，重庆 400715；2. 重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400715)

随着食品行业的发展，食品分析技术的作用日趋重要。应用化学分析方法，如原子吸收光谱法(atomic absorption spectroscopy，AAS)、气相色谱法(gas chromatography，GC)、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)以及各种联用方法如气质联用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)等，检测食品中有毒有害物质，但前处理过程繁杂、需要专业操作人员、分析步骤繁琐、设备昂贵[1-2]，并且受限于实验室使用，无法在食品生产与流通过程中实现有毒有害物质的实时检测。最主要的是这些技术虽然能检测化合物浓度，但不能反映有关样品的毒性[3]。生物学检测方法不仅可以估计样本毒性，还可以估计毒物对整个生态系统的综合影响[4]。经典生物测定通常使用小鼠、鱼类、藻类、甲壳类动物、植物或其他生物体[5]，但也存在缺点：需要特殊设备和专业操作人员，测定时间长、重现性低以及存在生物标准化争议[5-7]。因此寻找一种简单、快速且便宜的生物检测方法成为迫切的需求。

发光细菌是一类在正常代谢过程会发光的生物。自1969年Kossler阐述了基于生物发光细菌的生物测定法后[8]，发光细菌逐渐被用于各种环境污染物监测和食品单一及综合毒性评价。同时构建了以发光细菌发光强度变化为指标的有害物质检测标准，相关的检测试剂盒也陆续研制成功[9]。相较于化学检测，发光细菌检测具有前处理简单，反应快、灵敏度高、可实时监测，成本低、样品需求量少、实验室及耗材需求低等优点[10-11]，将成为食品安全检测新的发展方向，目前中国关于发光细菌检测的研究相对较少，缺乏对发光细菌在毒性评估和食品有毒有害物质检测方面的系统性分析和总结。

基于此，本文综述发光细菌在毒性评估及食品安全检测中的应用，对发光细菌检测存在的问题及未来的发展方向进行分析和总结，以期对发光细菌在食品有毒有害物质检测中的应用和新型检测仪器的开发提供理论依据。

1 发光细菌检测有毒有害物质的机理

1.1 发光细菌简介

生物发光是一种常见的现象，绝大多数生物发光有机体生活在海洋中，只有少数生活在陆地或淡水环境中。发光细菌是一类能够在正常代谢过程中发出蓝绿色光的生物，全部是革兰氏阴性菌，其大多为直杆菌，也有少数呈弧状或球杆状，有鞭毛。发光细菌个体微小，长度约为1.5～3.0 μm，宽度约为0.5～0.8 μm，释放的蓝绿色荧光波长范围为450～490 nm[12]。单个发光细菌发出的光极其微弱，肉眼几乎不可见，但当大量发光细菌聚集在一起时，发出的光则肉眼可见。

发光细菌属于变形菌门、γ变形菌纲。发光细菌可分为4个属：光杆菌属(Phototrhabdus)、发光杆菌属(Photobacterium)、希瓦氏菌属(Shewanella)和弧菌属(Vibrio)[12-13]。光杆菌属的典型菌有陆地发光杆菌(P.luminescens)、温和光杆菌(P.temperate)等，发光杆菌属的典型菌有明亮发光杆菌(P.phosphoreum)、鳆鱼发光杆菌(P.leiognathi)、夹孢发光杆菌(P.angustum)等，希瓦氏菌属的典型菌有羽田希瓦氏菌(S.hanedai)等，弧菌属的典型菌有哈维氏弧菌(V.harveyi)、费氏弧菌(V.fischeri)、青海弧菌(V.qinghaiensis)、霍乱弧菌(V.cholerae)等。

1.2 发光细菌检测机理

发光细菌中分子氧以还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛(RCHO)为底物，经胞内细菌荧光酶催化作用，将二者分别氧化为黄素核苷酸(FMN)和长链脂肪酸，同时伴随着波长为450～490 nm蓝绿光的释放，可以通过生物发光计检测。

在发光细菌中广泛存在表达荧光素基因(lux)。lux基因主要包括luxC、luxD、luxA、luxB、luxE 5个部分，其中luxA、luxB编码荧光素酶[14]，该酶是一种分子量为80 kDa的异二聚体蛋白，包括α(40～42 kDa)和β(36～37.5 kDa)2个亚基[15]，在其发光过程对FMNH2具有高度的特异性。luxC、luxD、luxE分别编码酰基蛋白还原酶(R，54 kDa)、酰基转移酶(t，33 kDa)和依赖ATP的合成酶(S，42 kDa)，这3种酶能够组成脂肪酸还原酶复合体催化醛类(该反应中参与发光的醛可能是十四醛)生成，使细菌持续发光[16]。海洋发光细菌，如明亮发光杆菌(P.phosphoreum)、鳆鱼发光杆菌(P.leiognathi)、哈维氏菌(V.harveyi)、费氏弧菌(V.fischeri)等，在luxE之后还有一个额外的基因luxG，有研究者[17]推测luxG基因产物是为萤光素酶反应提供FMNH-底物的黄素还原酶。发光细菌生物发光机理见图1[9]。

图1 发光细菌生物发光机理Figure 1 Luminescent bacteria bioluminescence mechanism

发光细菌检测机理分为特异性检测和非特异性检测，特异性发光细菌检测是根据受体-报告基因的原理(“lights on”模式)[18]，在lux上游导入特殊应激启动子，当宿主细胞的生长环境中有毒物存在时，毒物进入到宿主细胞，诱导特异性调控元件，进而调控下游基因表达，发出光源。非特异性检测利用的原理是发光细菌“lights off”模式[19-20]，即外来毒物通过直接抑制发光细菌酶的活性以及抑制细胞内有关发光反应的生理代谢对发光细菌形成发光抑制作用，见图2[19]。在“lights on”测定中，可定量的报道分子与已知的被测目标毒物活化的特定基因启动子融合，改变发光强度。在“lights off”测定中，样品毒性根据正常细胞活性的抑制程度估算，这种抑制可以发生在反应的任何阶段或影响细胞生长发育的任何位点。生物发光广泛依赖于细胞代谢，需要高能辅因子，因此，当接触到外界有毒有害物质时，发光细菌新陈代谢受到影响，进而使发光强度减小[21-22]。

图2 发光细菌检测有害物质原理Figure 2 The principle of detecting harmful substances by luminescent bacteria

2 发光细菌在毒性评估中的研究现状

2.1 利用发光细菌检测与传统急性毒性检测方法对比

生物毒性是指外源性物质与机体接触或进入机体后对机体产生的损伤，有急性毒性和慢性毒性2种。在应用发光细菌对毒物进行生物毒性评价时，发光细菌因在毒物中暴露时间较短，通常被认为是一种急性毒性评估。急性毒性的测试是毒理学安全性评价的基础性试验，是制订卫生管理标准不可或缺的依据[23]。随着急性毒性评价方法的不断发展，当前中国的急性毒性试验主要采用传统方法(GB 15193. 3—2003)[24]。但由于使用动物数量较大且LD50的测试受动物及实验室环境的影响，在“3Rs”原则，即减少(reduction)、优化(refinement)、替代(replacement)[25]下，衍生出了固定剂量法(fixed dose procedure，FDP)、急性毒性分类法(acute toxic class method，ATC)、上下法(up-and-down procedure，UDP)等方法，旨在采取其他措施来减少试验中动物的痛苦，这3种方法是目前常用的方法。其与利用发光细菌检测相比优缺点见表1[10,21,26-27]。

表1 急性毒性评估中传统方法和发光细菌检测方法的优缺点Table 1 Advantages and disadvantages of traditional methods and luminescent bacteria detection methods in acute toxicity assessment

2.2 发光细菌在毒性评估中的应用

细菌发光在毒理学中的应用从发光细菌应用于生态监测开始，目前仍被广泛地应用，关于发光菌在毒性评估中的研究与应用主要集中在环境科学的各个领域[28-29]。在食品行业，可见报道主要集中在发光细菌用于食品添加剂、农药和兽药的毒性评价。Cai等[30]研究了5种典型的农药(乐果、马拉硫磷、阿特拉津、灭草灵、乙草胺)对发光细菌的毒性作用及其作用机制。石颖等[31]分别用8种兽药作用于青海弧菌Q67，发现Q67的相对发光率与兽药浓度呈反比，并总结了8种兽药的抑制效率。

这些研究多集中在对单一物质的毒性评价，但在实际的检测应用中，食品成分具有复杂性，化学混合物的毒性具有联合作用，如拮抗作用、协同作用或加和效应等，发光细菌会受多种有毒物质的影响。因此，研究混合毒物对发光细菌的毒性作用具有重要的意义。基于此，吴淑杭[32]以青海弧菌、费氏弧菌和明亮发光杆菌T3为受试对象，研究重金属、农药和兽药等农产品污染物的单一毒性和联合毒性，揭示多种污染物共存时产生的毒性联合作用与综合生物毒性，并建立专用数学模型。

在联合毒性的研究中，选择合适的联合毒性评价模型进行毒性评价非常重要，常用的联合毒性评价方法有指数法、浓度加和与独立作用模型(CA/IA)法以及定量结构-活性关系模型(QSAR模型)预测法[33-34]。3种毒性评价方法各有优劣，在应用过程中应根据实际情况进行选择。目前关于这些模型在发光细菌中的应用也有诸多报道，张瑾等[35]以青海弧菌Q67为受试微生物，测定6种吡啶类离子溶液组成的4组二元混合物和2组三元混合物的联合毒性，用浓度加和模型进行分析，结果表明：除了有一组主要是拮抗作用外，其他组都是加和作用。董玉瑛等[36]测定了3种医药成分：阿奇霉素、盐酸环丙沙星和阿司匹林组成的混合体系对发光细菌的联合毒性，应用多种方法进行评价，得出的结果具有一致性，说明这些评价方法在联合毒性中具有可行性。

3 发光细菌在食品安全检测中的应用

3.1 发光细菌应用现状

表2显示了国内外学者利用发光细菌在部分食品安全检测中的应用。由表2可知，目前国内外的研究重点主要集中在以天然发光细菌为代表的非特异性发光细菌的应用上。在食品原料选择上，以农畜产品居多，比如蔬菜、肉类、奶类，很少涉及其他食品种类。而且在农畜产品中以畜产品为原料的研究最多，在检测毒物种类上，主要集中在对农兽药，尤其是对兽药进行检测，而对食品添加剂、食品中的生物毒素以及其他有毒有害物质的检测较少，并且在兽药检测中，很少涉及一些激素类兽药如糖皮质激素等的检测研究。

在发光细菌的选择方面，以青海弧菌为代表的淡水发光细菌逐渐成为研究的热门。因为与海洋发光细菌相比，青海弧菌在检测时不需要保证2%～3%的氯化钠浓度，避免了NaCl对样品特性的干扰。

在特异性发光细菌研究应用方面，目前在食品科学领域的研究报道较少，大多集中在四环素类抗生素以及少量关于β-内酰胺类药物的研究上。尽管特异性工程细菌在食品科学领域的研究应用刚刚起步，但其在环境科学中已有深入研究，已经建立了对多种重金属能够特异性检测的工程菌[46]。这些研究可以为发光细菌在食品安全检测中的应用提供借鉴。

3.2 检测效果的影响因素

发光细菌是一种生物检测技术，发光细菌本身具有不确定性，且样品的组成具有复杂性。因此在实际检测过程中，检测效果会受到多种因素的影响，如原料前处理、毒物兴奋效应、样品刺激作用等。

3.2.1 原料前处理 在食品安全检测中，样品前处理占据整个样品分析的大部分时间，并且检测结果的重复性、准确性以及方法的灵敏度都与样品前处理过程密切相关。理想的原料预处理方法，不仅能获得待检测物质，还能够减少对发光细菌检测的干扰。目前，在样品前处理中常用的方法有溶剂萃取法和离心法。在国内外的一些研究中，都是将原料绞碎、离心，然后取上清液备用[41,47-48]，但这些方法均存在提取不彻底的缺点，这使发光细菌检测技术不能准确地反映被检样品的毒性。并且在用有机溶剂萃取时，有机溶剂也可能会对发光细菌发光强度造成影响。因此，Pellinen等[40]在检测鱼肉中四环素时，对处理鱼肉样品的方法进行了优化，在均质之后不进行离心，也不使用有机溶剂，优化后的方案可使四环素的检出限更低。

表2 国内外学者在食品安全检测中应用发光细菌的部分研究Table 2 The application of luminescent bacteria in food safety detection

在利用发光细菌进行快速检测时，无色或颜色较浅的液体样品比较容易测试，而固体样品则必须经过前期处理才能进行检测。在固体样品的预处理方面，一些适用于其他生物检测的预处理方法如固相萃取[49]等，也适用于发光细菌检测。

3.2.2 毒物兴奋效应 毒物兴奋效应(Hormesis)是一种生物体的适应性反应，它是指在致毒因素不同的剂量强度范围，生物体具有不同的剂量—反应关系[50]。Hormesis通常被认为是毒物对生物体在高剂量时表现负面影响(如生长发育受到抑制)，但在低剂量时却表现为有益作用(如刺激生长发育)[51]，其主要应用于遗传毒性致癌物健康风险评估与毒物生态风险评估上。大多数农、兽药都显示出毒物兴奋效应，Calabrese等[51]指出青霉素、链霉素、土霉素、氯霉素、硫藤黄菌素、抗金葡美苏、磺胺、杆菌肽、吡啶硫胺素等药物在低剂量下能够刺激生物体生长；Morse[52]认为需要考虑农药的Hormesis，从而完整了解农药的潜在影响。

在发光细菌毒性评估中，也会出现毒物兴奋效应。汤淼等[53]以费氏弧菌作为受试生物，盐酸四环素作为研究对象，证明了在细菌生长的延滞期和平台期，盐酸四环素对费氏弧菌的发光强度存在时间依赖型毒物兴奋效应。Shen等[54]通过建立剂量—效应曲线和时间—效应曲线研究了Cu、Zn、Cd、Cr对青海弧菌的影响，并发现4种金属对青海弧菌具有明显的毒物兴奋效应。

3.2.3 样品刺激作用 在利用发光细菌进行毒性评估和食品安全检测时，样品中的某些非研究对象也会引起发光细菌发光强度的变化。已有的研究表明，低剂量的K+、Ca2+、Na+等无机离子均对天然发光细菌产生刺激作用[53]，并且这种刺激作用在淡水重组菌中并未出现减弱现象[55]。

样品的刺激作用具有两面性，在海洋发光细菌利用过程中，需要2%～3%的NaCl溶液来模仿海洋环境，并用其处理样品，溶液中的KCl、NaCl等无机物会对发光细菌产生刺激作用，在毒性测试中使发光细菌保持最大发光强度。但是这种盐溶液有可能会改变样品性质，如降低金属的生物利用率和有机物的溶解性[56]，这都会使检测误差偏大。

4 结论与展望

发光细菌繁殖速度快，易于培养和观察，这为其在检测中的应用提供了一个广阔的发展空间。发光细菌检测方便快捷且成本低，虽然在环境科学领域已经取得长足的发展，但在食品科学领域，尤其是在食品安全检测中的研究与应用起步较晚，其前期研究主要停留在整体水平以及细胞水平，目前正向基因水平和分子水平的方向纵深发展。因此，在食品领域，对发光细菌展望如下：

(1) 发光细菌在食品安全检测中的应用研究范围需要扩大，不应仅仅停留在农畜产品检测方面，应拓宽至其他深加工食品中；并且被检测物质应包含农药残留、兽药残留、食品添加剂以及生物毒素等有毒有害物质，全方位地确保食品安全。

(2) 在诸多限制发光细菌检测发展的因素中，原料前处理方式、毒物兴奋效应以及样品自身的刺激作用是制约该方法发展的主要因素，应寻求合理的解决方式减少这些影响。

(3) 在特异性发光细菌研究方面，应积极借鉴其他领域的成功经验，构建出在食品有毒有害物质检测中能实现特异性检测的发光细菌。

(4) 在热门发光细菌青海弧菌的研究方面，应对发光机理及毒物兴奋效应进行系统研究，从而为其在食品安全检测中的应用提供理论依据。

(5) 制定关于发光细菌在食品行业使用的统一标准，现在可作为参考的只有GB/T 15441—1995，发光细菌的研究取得了很大进展，如发光细菌冻干粉、发光细菌固体培养试剂盒以及发光细菌毒性检测仪的商业化。因此，急需完善相关的标准政策，以推动该产业的健康快速发展。