昆仑雪菊茶总黄酮提取及抗氧化活性研究

王家妮 明 建,2 田 勇 王荣杰 李福香

(1. 西南大学食品科学学院，重庆 400715； 2. 西南大学国家食品科学与工程实验教学中心，重庆 400715)

昆仑雪菊学名两色金鸡菊(CoreopsistinctoriaNutt.)[1]，系菊科(Compositae)金鸡菊属(Coreopsis)一年生草本植物，因其生长在新疆昆仑山脉海拔3 000 m以上的高寒积雪地区而得名“雪菊”[2]。研究表明，昆仑雪菊含有黄酮、有机酸、皂苷、鞣质、不饱和脂肪酸、三萜类、多肽类等多种活性成分[3-4]，其中黄酮类化合物含量最为丰富[5]。昆仑雪菊黄酮具有抗氧化[6-7]、降血脂[8]、降血糖[9]、抗炎[10]、降血压[11]和抗衰老[12]等多种生物活性。

目前，国内外对昆仑雪菊黄酮类化合物的提取主要采用有机溶剂法[13-14]，鲜有用水直接浸提的研究报道。但在日常生活中，雪菊的主要摄入方式为传统茶饮，因此更应当关注其亲水活性成分。李宝文等[15]研究了昆仑雪菊中水溶性黄酮的提取工艺，其提取方法不同于传统茶饮冲泡，而模拟传统茶饮冲泡方式，更具有实际价值。因此，本研究模拟传统茶饮冲泡方法，对昆仑雪菊茶总黄酮进行水浸提，通过响应面法优化浸提工艺，并对昆仑雪菊茶总黄酮的体外抗氧化活性进行研究，以期为昆仑雪菊茶饮的开发及研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

昆仑雪菊：采自新疆昆仑山海拔3 000 m以上的高寒地区，购于新疆和田地区；

芦丁、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、荧光素钠盐(FL)、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)：分析纯，美国Sigma公司；

2,2′-偶氮二异丁基脒盐酸盐(ABAP)：分析纯，日本Wako Chemicals公司；

亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁等：分析纯，成都市科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

分光光度计：JH722型，上海精科科学仪器厂；

数显恒温水浴锅：HH-2型，常州澳华仪器有限公司；

分析天平：FA1004A型，上海精天电子仪器有限公司；

pH计：PB-10型，德国赛多利斯公司；

微型台式离心机：1-15PK型，德国赛多利斯公司；

多功能酶标仪：Syhergy H1型，美国基因公司。

1.3 试验方法

1.3.1 单因素试验

(1) 浸提时间：精确称取3.0 g昆仑雪菊样品放入三角瓶中，按料液比1∶80 (g/mL)与水混合，在90 ℃下分别浸提2，5，8，11，14，17 min，测定浸提时间对总黄酮得率的影响。

(2) 浸提温度：精确称取3.0 g昆仑雪菊样品放入三角瓶中，按料液比1∶80 (g/mL)与水混合，分别在75，80，85，90，95，100 ℃下浸提14 min，测定浸提温度对总黄酮得率的影响。

(3) 料液比：精确称取3.0 g昆仑雪菊样品放入三角瓶中，分别按料液比1∶50，1∶60，1∶70，1∶80，1∶90，1∶100 (g/mL)，在90 ℃条件下浸提14 min，测定料液比对总黄酮得率的影响。

1.3.2 雪菊茶总黄酮含量测定

(1) 标准曲线的制备：参照文献[16]。得到标准曲线的回归方程：Y= 0.012 7x-0.011 4(R2=0.999 7)。

(2) 样品黄酮含量的测定：取1 mL茶汤样品(可作适当稀释)，置于25 mL容量瓶中，后续操作与标准曲线制备相同。

1.3.3 雪菊茶总黄酮得率计算

(1)

式中：

c——提取率，%；

m1——提取的总黄酮质量，g；

m2——干燥原料的质量，g。

1.3.4 响应面试验设计优化浸提工艺 结合单因素试验结果，对雪菊茶总黄酮浸提工艺进行响应面试验设计及回归方程方差分析。以总黄酮得率为响应值，浸提时间、浸提温度、料液比作为考察因素，选取5个中心点进行17个试验，并对试验结果进行响应面分析。

1.3.5 昆仑雪菊茶抗氧化活性测定

(1) 清除DPPH·能力：根据Cheung等[17]的方法。按式(2)计算DPPH·清除能力。

(2)

式中：

K——DPPH·清除率，%；

Ai——样品液吸光度；

Aj——纯水吸光度。

(2) 铁还原能力测定(FRAP)：根据Luanda等[18]的方法。

(3) 氧自由基吸收能力测定(ORAC)：根据Wolfe等[19]的方法。按式(3)、(4)分别计算AUC值和ORAC值。

AUC=(0.5×f1/f1+f2/f1+f3/f1+……+fn/f1+……+f30/f1+0.5×f30/f1)×CT，

(3)

(4)

式中：

f1——第1次荧光读数；

fn——第n次荧光读数；

CT——间隔测定时间4.5 min；

AUC样品——样品荧光衰减下的面积；

AUC空白——空白液荧光衰减下的面积。

用Trolox当量(μmol TE/g)来表示ORAC值。

1.4 试验数据分析

采用Excel 2010计算平均值和标准偏差，Origin 8.0软件进行单因素试验分析，响应面试验设计与方差分析使用Design-Expert 8.0.6软件进行。所有试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 浸提时间对昆仑雪菊茶总黄酮得率的影响 由图1可知，在2～11 min时雪菊茶总黄酮得率随浸提时间的增加而增加，超过11 min以后基本保持不变。分析其原因可能是昆仑雪菊中黄酮随着浸提时间的延长不断溶出，当时间达到11 min时，雪菊中黄酮基本溶出，此后随着浸提时间的延长，总黄酮得率不再变化。因此选择最佳浸提时间为11 min。

图1 浸提时间对昆仑雪菊茶总黄酮提取的影响

Figure 1 Effect of extraction time on the yield of flavonoids ofCoreopsistinctoriatea

2.1.2 浸提温度对昆仑雪菊茶总黄酮得率的影响 由图2可知，在一定温度范围内，昆仑雪菊茶总黄酮得率与浸提温度呈正相关，当浸提温度达到95 ℃时，总黄酮得率达到最大值18.22%，当温度高于95 ℃雪菊茶总黄酮得率有所下降。因此选择最佳浸提温度为95 ℃。

2.1.3 料液比对昆仑雪菊茶总黄酮得率的影响 由图3可知，随着加水量的增加，昆仑雪菊茶总黄酮得率呈先增加后减少的趋势，在料液比为1∶80 (g/mL)时总黄酮得率达到最大值，与宋佳敏等[20-21]研究结果一致。这可能是当加水量较少时，在稀释作用下黄酮随着提取液的增加溶出更加充分，但加水量太大会导致体系的比热容增大，可能会加剧对黄酮结构的破坏[21]。因此选择最佳料液比为1∶80 (g/mL)。

图2 浸提温度对昆仑雪菊茶总黄酮提取的影响

Figure 2 Effect of extraction temperature on the yield of flavonoids ofCoreopsistinctoriatea

图3 料液比对昆仑雪菊茶总黄酮提取的影响

Figure 3 Effect of material-to-liquid ratio on the flavonoids ofCoreopsistinctoriatea

2.2 提取工艺的优化

2.2.1 响应面优化结果 根据单因素试验结果，选取对昆仑雪菊茶总黄酮得率有影响的浸提时间、浸提温度、料液比因素，设计三因素三水平响应面试验。表1为因素水平编码表，表2为试验方案设计及结果。

表1 设计试验因素水平及编码Table 1 Factor level and coding of Box-Behnken design

使用Design Expert 8.0.6软件，对表2中数据进行处理，得到如表3所示的该模型回归方程方差分析表，对数据进行非线性回归的二项式拟合，得到以下预测模型：

R=19.86+0.76A+0.71B+0.21C+0.12AB-0.21AC-0.14BC-0.61A2-0.79B2-0.17C2。

(5)

表2 响应面试验设计方案及结果Table 2 Design-expert design scheme and experimental results

从表3可以看出，3个因素的一次项及二次项对总黄酮得率的影响极显著(P<0.01)，3个因素之间交互作用均显著(P<0.05)。由F值可知，各因素对昆仑雪菊茶总黄酮得率影响的大小次序依次为：浸提时间>浸提温度>料液比。

表3 优化后模型方差分析表†Table 3 Significance test for coefficient of the regression model developed

† **表示极显著(P<0.01)，*表示显著(0.01

2.2.2 响应面分析 图4可以直观地反映出浸提时间、浸提温度和料液比三因素之间的交互作用对总黄酮得率的影响。各因素对总黄酮得率的影响程度可以通过响应曲面陡峭程度反映，响应曲面陡峭表明对总黄酮得率影响显著，响应曲面平缓，表明该因素对总黄酮得率影响不显著[22]。比较模型的响应曲面陡峭程度：浸提时间>浸提温度>料液比，表明各因素对总黄酮提取率的影响大小顺序为：浸提时间>浸提温度>料液比，其结论同表3方差分析结论一致。等高线的形状可反映出各因素间交互作用的强弱，趋于椭圆形表明两因素的交互作用显著，而圆形表明不显著[23]，图4(a)～(c)中各因素相互作用得到的等高线均为椭圆形，表明浸提时间与浸提温度、浸提时间与料液比、浸提温度与料液比交互作用显著，与模型的方差分析结果一致。

2.2.3 最优浸提工艺条件的验证 根据Design-Expert 8.0.6软件，结合实际操作条件，响应面优化的模型得出最优条件为：浸提时间13 min、浸提温度98 ℃、料液比1∶78 (g/mL)，提取率为20.30%。根据优化后的最佳工艺参数提取，验证实验重复3次，取平均值，黄酮得率为(20.39±0.07)%，与预测模型得出的理论值相比较，偏差<0.33%，说明该模型具有可靠性，可以用于预测昆仑雪菊茶浸提总黄酮得率。

2.3 雪菊茶的体外抗氧化活性评价

如图5所示，昆仑雪菊茶DPPH·清除能力的半数有效浓度值(IC50)为(82.40±1.98) μg/mL，弱于抗坏血酸的[(18.70±0.89) μg/mL]；铁还原力IC50值为(137.98±1.56) μg/mL，弱于抗坏血酸的[(60.41±0.62) μg/mL]，表明昆仑雪菊茶具有一定的铁还原能力及抗氧化活性。同时，研究发现昆仑雪菊茶的ORAC值为1 427.89 μmol TE/g·DW，显著高于徐维盛等[24]测定的闵红茶(1 379.10 μmol TE/g·DW)、乌龙茶(1 270.70 μmol TE/g·DW)以及古丈毛尖茶(1 247.10 μmol TE/g·DW)，表明昆仑雪菊茶具有良好的氧自由基清除能力。

图4 等高线及响应曲面图Figure 4 Contour plots and response surface

图5 昆仑雪菊茶抗氧化能力Figure 5 Antioxidant Capacity of Coreopsis tinctoria tea

3 结论

本研究通过模拟日常冲泡花茶的方法，以昆仑雪菊茶总黄酮浸出得率为评价指标，采用单因素试验和Box-Behnken响应面法优化昆仑雪菊茶浸提总黄酮的最佳工艺条件，并评价其体外抗氧化活力。工艺优化结果表明，最佳浸提条件为：浸提时间13 min、浸提温度98 ℃、料液比1∶78 (g/mL)，该条件下昆仑雪菊茶中总黄酮得率高达20.30%，以数学模型得到的浸提条件进行验证实验，相对误差较小(RSD<0.33%)，表明回归模型优化得到的浸提工艺条件是有效的，具有实用价值。

另外，昆仑雪菊茶黄酮的抗氧化活性研究表明，在一定浓度范围内，昆仑雪菊茶抗氧化能力随总黄酮浓度的增加而增加，且线性关系良好。昆仑雪菊茶的清除DPPH·IC50值为(82.40±1.98) μg/mL，还原铁离子的IC50值为(137.98±1.56) μg/mL，ORAC值为1 427.89 μmol TE/g·DW，表明昆仑雪菊茶表现出较好的抗氧化活性，可作为一种天然抗氧化剂来源，具有良好的发展前景。

本研究以水为溶剂，采用传统茶饮冲泡方式，更具有实际意义。本文仅研究了昆仑雪菊茶中总黄酮的浸提工艺条件及体外抗氧化活性，而昆仑雪菊茶饮中总黄酮的开发利用及抗氧化有效单体成分有待进一步研究。