UPLC-UV-QDa联用系统快速分析野生樱桃李叶化学成分

刘 伟 刘天琦 葛豫炜 欧阳艳

(伊犁师范学院新疆维吾尔自治区普通高校天然产物化学与应用重点实验室，新疆 伊宁 835000)

野生樱桃李(Prunuscerasifera)俗称野酸梅，蔷薇科李属，落枝灌木或小乔木[1]。植株多分枝，成熟叶片为椭圆形、卵圆形或倒卵形，少数出现椭圆状披针形。就世界范围而言，野生樱桃李主要分布于中亚天山、高加索、小亚细亚及巴尔干半岛[2]，樱桃李的野生种在中国仅分布于新疆伊犁地区霍城县的科古尔琴山的大西沟和小西沟等的10多条山沟中，集中分布于海拔1 000～1 600 m的沟谷和多石砾的阳坡地，已被列为国家Ⅱ级重点保护植物和新疆维吾尔自治区Ⅱ级重点保护植物。中国学者[3-4]对野生樱桃李的研究多集中在其生态、栽培及果实营养成分等方面，对其有效成分的提取与活性研究近年来才逐步开展。野生樱桃李果实抗氧化活性与多酚含量有明显相关性，矢车菊3-半乳糖苷、矢车菊3-葡萄糖苷是樱桃李果皮中含量最多的花色苷[5-7]。课题组[8-10]前期研究发现野生樱桃李叶醇提物中含有多种黄酮类化合物，具有很好的抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性，为野生樱桃李叶发挥活性的重要物质基础，但对化学成分的分离纯化和鉴定尚未见报道。近年来从天然产物中寻找可能发展为新药的先导化合物的研究备受重视，对于活性物质的快速分析在天然产物研究中具有重要意义。HPLC-MS/MS技术在化学成分研究中的应用已显优势，是天然产物药效物质基础研究的有力手段，但其昂贵的价格以及对使用者的技术要求阻碍了它的普及[11]。ACQUITY QDa与传统质谱相比较，直观易用，节约时间，能在常规分析中获得具有一致性的高质量质谱数据。本试验拟建立UPLC法快速测定野生樱桃李叶黄酮苷元含量的检测方法，利用UPLC-UV-QDa联用系统快速分析鉴定野生樱桃李叶中化学成分，为物质基础的导向性分离提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

野生樱桃李叶：分别于2017年9月采自新疆伊犁霍城县大西沟，其中样1紫果叶、样2红果叶均采样于阳坡，样3紫果叶、样4红果叶均采样于沟谷，经伊犁师范学院资源与生态研究所赵玉教授鉴定为蔷薇科野生樱桃李叶，洗净，阴干后60 ℃烘干至恒重，粉碎过60目筛备用，树叶标本存放于伊犁师范学院资源与生态研究所；

山奈酚、槲皮素、异鼠李素：HPLC≥98%，上海源叶生物科技有限公司；

D-半乳糖、D-木糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖：HPLC≥98%，上海源叶生物科技有限公司；

乙醇、盐酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

甲醇、甲酸：色谱纯，阿达玛斯试剂(上海)有限公司；

石油醚(60～90 ℃)：分析纯，天津市北联精细化学品开发有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

超高效液相色谱仪：ACQUITY UPLC H-Class，配备光电二极管矩阵(PDA)检测器，美国Waters公司；

质谱仪：ACQUITY QDa质谱检测器，美国Waters公司；

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)，美国Waters公司；

电子天平：Sartorius BSA124S型，德国赛多利斯科学仪器有限公司；

集热式磁力加热搅拌器：DF-101S型，金坛市医疗仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 混合标准液的配制 分别精密称取2.5 mg槲皮素、5.0 mg山奈酚、2.5 mg异鼠李素置于25 mL容量瓶中，无水甲醇超声溶解，冷却后定容，得到质量浓度分别为100，200，100 μg/mL 的标准品储备液。取储备液进行稀释，配制20，40，60，80，100，120，200 μg/mL(以山奈酚计)的混合标准液，过0.22 μm微孔滤膜，取滤液于4 ℃保存备用。

1.2.2 样品溶液的制备 称取0.25 g野生樱桃李(样1)叶2份，加入石油醚(60～90 ℃)25 mL，水浴加热至沸腾，并保持微沸1 h，脱脂，去叶绿素，抽滤后将滤渣晾干。其中1份加入无水甲醇25 mL，另1份加入无水甲醇20 mL和4 mol/L 的盐酸5 mL，分别于80 ℃回流3.0 h，抽滤，离心后将滤液用无水甲醇定容至25 mL容量瓶中，得到野生樱桃李叶醇提物和水解液，取1.0 mL过0.22 μm微孔滤膜，取滤液于4 ℃保存备用。

1.2.3 色谱条件 色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)；流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为甲醇。标准品和水解样品分析色谱条件Ⅰ：梯度洗脱方法为0～7 min，35%～52% B；7～8 min，52%～100% B；8～9 min，100%～35% B。流速0.3 mL/min；进样体积1.0 μL；柱温30 ℃；检测波长360 nm。醇提物分析色谱条件Ⅱ：梯度洗脱方法为0～10 min，5%～22% B；10～11 min，22%～28% B；11～32 min，28%～43% B，流速0.3 mL/min；进样体积1.0 μL；柱温30 ℃；检测波长360 nm。

1.2.4 质谱条件 ACQUITY QDa质谱检测器，Performan-ce模式；ESI负离子全扫描，100～800 Da；锥孔电压15 V，毛细管电压0.8 kV；离子源温度600 ℃；Empower操作系统。

1.2.5 标准曲线和样品测定 按照1.2.3色谱条件进样1.0 μL，以峰面积(Y)与相应的浓度(X)分别绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品中黄酮苷元的含量。

1.2.6 方法学考察 参考文献[12～13]，以预试验优化的色谱条件Ⅰ进行方法学考察。取同一份混合标准品(山奈酚浓度为100 μg/mL)，重复进样6次，每次进样1.5 μL，计算相应保留时间和峰面积的RSD，考察试验精密度；取样1水解液每隔2 h进样1.5 μL，进样6次，计算相应峰面积的RSD，考察试验稳定性；平行称取0.25 g样1共5份，按照1.2.2方法制备水解液，分别进样1.5 μL，计算槲皮素和山奈酚含量和相应峰面积的RSD，考察试验重复性；平行称取0.25 g样1共6份，分别向样品中添加低、中、高质量的标准品(相当于样品中含量的80%，100%，120%)，按照1.2.2方法制备水解液6份，分别进样1.5 μL，根据标准曲线计算槲皮素和山奈酚的含量、回收率和RSD，考察试验加标回收率。

1.2.7 样品含量测定 采用外标法测定4种不同样品中黄酮苷元的含量，参考Sticher等[14]提出的通过转换因子(槲皮素、山奈酚转换因子分贝为2.51和2.64)由黄酮苷元计算总黄酮含量的方法，根据公式计算4种不同样品总黄酮含量。

2 结果与分析

2.1 水解试验

由图1可知，野生樱桃李叶水解液色谱图中峰1、峰2分别与标准品槲皮素、山奈酚保留时间一致，且表现出相同的特征紫外吸收，可确定峰1、峰2为槲皮素和山奈酚，水解样品中未检测到异鼠李素。取水解液以乙酸乙酯—异丙醇—水为展开剂，通过苯胺—二苯胺-磷酸法显色，发现水解产物中存在鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖(极性由小到大)。说明野生樱桃李叶中主要含有以槲皮素和山奈酚为苷元的黄酮类化合物。

图1 混合标准品和野生樱桃李叶水解液UPLC色谱图Figure 1 UPLC chromatograms of reference substances and hydrolysates

2.2 标准曲线绘制

按照1.2.3色谱条件Ⅰ将不同质量浓度的混合标准液各进样1.5 μL，以峰面积(Y)与相应的浓度(X)绘制标准曲线并进行线性分析，得到混合标准品的回归方程、相关系数和线性范围，结果见表1。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度 结果显示，槲皮素、山奈酚、异鼠李素保留时间分别为4.1，5.9，6.4 min，保留时间RSD值分别为0.86%，0.67%，0.59%；峰面积的RSD值分别为1.08%，0.74%，0.75%，表明仪器的精密度较好。

表1 标准品的线性关系和精密度考察Table 1 Linear relationship and precision of three standard samples (n=7)

2.3.2 稳定性 结果显示，槲皮素、山奈酚峰面积的RSD分别为0.98%，0.49%，表明水解液室温下12 h内稳定。

2.3.3 重复性 根据标准曲线计算原料中槲皮素和山奈酚平均含量分别为3.651 4，7.679 6 mg/g，峰面积的RSD分别为1.29%，1.07%，表明方法重复性良好。

2.3.4 加标回收率 由表2可知，槲皮素和山奈酚的平均回收率分别为98.65%，102.02%，RSD均小于2%，说明方法的准确度良好。

2.4 样品的测定

由表3可知，不同样品所含黄酮苷元中山奈酚含量均明显高于槲皮素，说明野生樱桃李叶中黄酮类成分以山奈酚苷类化合物居多。阳坡样品总黄酮含量均高于沟谷样品，诸姮等[15]研究发现光照能够强烈地影响植物的初生代谢、植物细胞生长及次生代谢产物积累。分析原因是阳坡日照时间长、辐射强度大、土壤干燥等因素促使野生樱桃李叶产生抗逆性，局部器官或组织合成较多的黄酮类化合物，以利于自身的保护。文献[16]报道不同遗传背景的植物存在成分和含量差异，与本试验中不同生长环境下紫果叶中黄酮苷元总含量均高于红果叶相吻合。

表2 野生樱桃李叶中添加标准品的回收率Table 2 Recoveries of standards in extraction of leaves (n=3)

表3 不同供试品中黄酮含量测定Table 3 Determination of the flavonoids content in different samples (n=3) mg/g

2.5 醇提物化学成分

由图2可知，醇提物中化合物1极性较大且含量较高；化合物2～9保留时间集中在13～18 min，说明化合物极性相近；化合物10～12含量较低，各峰之间分离度可满足质谱分析。

ACQUITY QDa质谱检测器直观易用，摆脱了传统质谱仪的操作复杂性，可快速获得高质量的质谱数据，对化合物进行快速鉴定，补充了诸如PDA等光学检测器的不足。本试验基于野生樱桃李叶醇提物化学成分的紫外和质谱数据，结合水解试验，根据课题组前期研究积累经验并参考文献[17～25]，对野生樱桃李叶醇提物黄酮成分进行快速分析，结果见表4。其中1号峰UVmax为219, 230, 326 nm，分子离子峰m/z为353.20 [M-H]-，推测为单咖啡酰奎宁酸[22,26]。10、11、12号峰含量较低，质谱数据复杂，未做推断。

图2 野生樱桃李叶醇提物UPLC谱图Figure 2 UPLC chromatograms of methanol extract from Prunus cerasifera Leave表4 野生樱桃李叶醇提物黄酮苷紫外质谱分析结果Table 4 UV and MS analysis results of flavone glycosides of methanol extract

峰号保留时间/minUVmax /nm[M-H]-(m/z) 黄酮苷元推测单糖类型单糖个数文献213.927255, 356463.25槲皮素半乳糖、葡萄糖单糖[17～18]314.348255, 356463.21槲皮素半乳糖、葡萄糖单糖[17～18]414.759264, 349431.26山柰酚鼠李糖单糖[19～20]515.027266, 346563.22山奈酚鼠李糖和阿拉伯糖或木糖双糖[19, 21]616.054255, 351433.19槲皮素木糖苷、阿拉伯糖单糖[22～23]716.652264, 348609.22山奈酚半乳糖、葡萄糖双糖[17～18]817.017264, 346563.19山奈酚鼠李糖和阿拉伯糖或木糖双糖[19～20]917.126264, 344577.23山奈酚鼠李糖双糖[24～25]1019.175264, 335-山奈酚--1120.106264, 337-山奈酚--1221.495255, 349-槲皮素--

3 结论

本试验结果表明，以槲皮素和山奈酚为苷元，与鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖等缩合而成的黄酮苷为野生樱桃李叶中主要成分。UPLC测定水解产物中槲皮素和山奈酚的含量在7 min内完成，精密度RSD值分别为1.08%，0.74%，重复性RSD值分别为1.29%，1.07%，稳定性RSD值分别为0.98%，0.49%，平均回收率分别为98.65%，102.02%，RSD均小于2%，说明该方法快速、准确、可行。4种不同样品的总黄酮含量为(19.15±2.94)～(29.69±3.56) mg/g，其中阳坡紫果叶>沟谷紫果叶>阳坡红果叶>沟谷红果叶。通过UPLC-UV-QDa联用系统快速分析阳坡紫果叶醇提物主成分为1种单咖啡酰奎宁酸、4种槲皮素糖苷、7种山奈酚糖苷。UPLC-UV-QDa联用系统使分离和鉴定同时进行，能够快速、准确、有效地鉴别物质。对野生樱桃李叶醇提物化学成分结构的确定，课题组将通过柱色谱和制备色谱等手段分离、纯化后进一步研究。