PD-L1调节结直肠癌细胞生物学行为的作用研究

熊振芳 ，熊秋迎 ，万红萍 ，时军

(南昌大学第一附属医院，1、病理科；2、普外科，南昌 330006)

结直肠癌是严重威胁人类健康的常见恶性肿瘤之一。目前，我国结直肠癌的发病率高居恶性肿瘤的第3位，而死亡率位居第4位[1]，近年来尽管治疗水平明显提高，但结直肠癌仍然是主要的致死癌症之一，晚期结直肠癌患者的5年生存率尚不足5%[2]。近年来，针对免疫卡控点药物引领了肿瘤治疗进入免疫治疗的新时期，也为结直肠癌的治疗提供了新策略。PD-L1（Programmed death ligand-1，程序性死亡分子配体-1）是B7/CD28协同刺激分子超家族中主要成员之一，起负性调节作用。在正常条件下，PD-L1主要表达于淋巴细胞，但在多种恶性肿瘤中发现有PD-L1的表达[3]。研究表明，很多肿瘤PD-L1蛋白表达与临床病理因素存在相关性。有研究发现，PD-L1在肺癌、鼻咽癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤中表达并提示患者预后较差[4-10]。本课题组前期研究结果也显示，在结直肠癌中PD-L1的高表达状态和肿瘤浸润侵袭、淋巴结转移以及患者生存期显著相关，提示PD-L1可以成为结直肠癌重要的分子生物学标志，对于评估肿瘤免疫逃逸应答水平具有重要的意义。其在结直肠癌中的生物学功能和临床应用前景值得深入探讨。

基于以上背景，本课题组通过构建慢病毒转染系统下调PD-L1基因在直肠癌细胞系中的表达，观察PD-L1表达下调后对细胞生物学功能的影响，探讨PD-L1对结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移的作用。

1 资料与方法

1.1 仪器与试剂 3种结直肠癌细胞系 （HT-29、

通信作者：时军HR8348、SW480）、 细胞裂解液、FBS 胎牛血清、DMEM高糖完全培养基、DMSO冻存液、总RNA提取试剂盒、HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒、流式细胞仪、PCR扩增仪。

1.2 方法

1.2.1 实验共分3组 PD-L1沉默慢病毒组、空载体组、空白组。

1.2.2 慢病毒包装 ⑴取生长状态良好的细胞，0.05%-0.25%胰酶消化后，悬浮细胞，接种于培养皿中（培养条件：37℃，5%CO2培养过夜）；⑵去除培养液，换Opti-MEM培养液；⑶质粒混合：向EP管中加入 250μl无血清 Opti-MEM、0.5μg表达质粒和1.5μg包装混合质粒，室温孵育5min；⑷Lipo稀释：向EP管中加入250μl Opti-MEM和9μl脂质体，室温孵育5min；⑸将脂质体溶液和DNA溶液混匀，室温孵育20min；⑹胰酶消化后用DMEM培养基重悬细胞；⑺向六孔板中加入DNA-脂质体混合物和含血清的生长培养基；⑻将重悬的细胞加到平板中，37℃，5%CO2孵育过夜；⑼除去含有DNA-脂质体复合物的培养基，代之以DMEM；⑽48-72h之后收集含病毒的上清，3000rpm离心20min，去除沉淀，病毒上清于－80°C冰箱贮存。

1.2.3 细胞转染 ⑴当细胞的融合度满意时，弃除培养液，PBS洗涤2次，胰蛋白酶消化3min；⑵加入DMEM，将细胞吸取到离心管中离心，取沉淀物，再加入DMEM完全培养基并分别接种到6孔板、24孔板和96孔板中，培养箱中培养（37℃，5%CO2）；⑶细胞生长状态良好时，分别进行空白对照、空载体、沉默PD-L1转染。

1.2.4 流式检测细胞凋亡和细胞周期 ⑴转染48h后收集细胞，PBS洗涤2次，胰蛋白酶消化1min，再加入含10%FBS的DMEM；⑵将细胞吸取到1.5ml离心管中离心，弃除上清，用PBS洗涤2次，收集细胞；⑶将细胞分为两份，一份用Binding Buffer悬浮细胞，再加入 5μl Propidium Iodide和 5μl Annexin V-FITC，常温避光孵育5-15min，于1h内用流式细胞仪检测细胞凋亡；⑷另一份加入70%的乙醇溶液充分固定2h，用流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.5 侵袭实验 ⑴细胞转染48h后，将侵袭小室放入10%中性福尔马林固定液中固定15min；⑵取出侵袭小室，用PBS洗涤2次，放入新鲜配制的姬姆萨染色液中反应15min；⑶取出侵袭小室，将小室内部细胞用滤纸擦去，显微镜下拍照观察。

1.2.6 划线实验 ⑴当6孔板中的细胞铺满板底后，用枪头垂直于孔板间隔相同距离划痕；⑵取出孔板，用PBS清洗划痕上的细胞碎片；⑶加入无血清培养基后放入培养箱培养，间隔4-6h拍照记录。

1.2.7 细胞增殖和毒性检测 ⑴细胞消化后，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基；⑵96孔板每孔接种约4000个细胞，每孔加入100μl的培养基，置于培养箱（37℃，5%CO2）中孵育；⑶待细胞生长状态良好时转染相应慢病毒；⑷48h后，弃除培养基，每孔加入新鲜配制的毒性检测液CCK8 10μl；⑸培养箱培养4h后，用酶标仪检测波长为450nm的OD值。实验重复3次，取平均值作为最终实验结果。按公式计算生长抑制率=[(对照组OD-实验组OD)/对照组 OD]×100%。

图2 HR8348细胞系实验分组的凋亡图

图3 SW480细胞系实验分组的凋亡

2.2 流式检测细胞周期 ⑴HT-29细胞：与对照组比较，空载组细胞周期变化不明显，而PD-L1基因沉默组中S期细胞比例减少，G1期细胞比例明显增多。⑵HR8348细胞和SW 480细胞：与对照组比较，PD-L1基因沉默组和空载组的细胞周期比例变化不明显。见图4-6。

2 结果

2.1 流式检测细胞凋亡 每种结直肠癌细胞系3个不同实验组中，与对照组及空载组比较，PD-L1基因沉默组凋亡率显著增加。说明PD-L1基因沉默后，可以促进细胞凋亡。见图1-3。

图4 HT-29细胞系实验分组的细胞周期图

图1 HT-29细胞系实验分组的凋亡图

图5 HR8348细胞系实验分组的细胞周期图

图6 SW 480细胞系实验分组的细胞周期图

2.3 侵袭实验 ⑴HT-29细胞：PD-L1基因沉默后，细胞侵袭能力降低。空载组、对照组、PD-L1基因沉默组细胞侵袭数目分别为46个、27个、17个。⑵HR8348细胞：PD-L1基因沉默后，细胞侵袭能力显著降低。空载组、对照组PD-L1基因沉默组细胞侵袭数目分别为127个、140个、48个。⑶SW480细胞：PD-L1基因沉默后，细胞侵袭能力有所降低。空载组、对照组、PD-L1基因沉默组细胞侵袭数目分别为78个、98个、59个。说明PD-L1表达下调后，细胞侵袭能力显著下降，差异具有统计学意义（P<0.05）。见图7-10。

2.4 划线实验 每种结直肠癌细胞系3个不同实验组中，与对照组及空载组比较，PD-L1基因沉默组细胞迁移能力显著被抑制。见图11。

图7 HT-29细胞系实验分组的细胞侵袭图

图8 HR8348细胞系实验分组的细胞侵袭图

图9 SW 480细胞系实验分组的细胞侵袭图

图10 3种细胞系实验分组的细胞侵袭数目柱状图

图11 3种细胞系实验分组的细胞迁移距离柱状图

2.5 细胞增殖和毒性检测 下调PD-L1表达，能显著抑制3种细胞系的增殖能力，差异具有统计学意义（P<0.05）。见图 12。

图12 3种细胞系实验分组CCK8检测OD图

3 讨论

PD-1是协同刺激受体，是免疫球蛋白超家族成员之一，主要功能是传导抑制信号的。其配体即为共刺激分子PD-L1，是首个被鉴定的负性共刺激分子，属B7超家族成员。生理状态下，PD-L1表达于免疫细胞、抗原提呈细胞等表面。PD-1/PD-L1信号传导通路能传递抑制性信号，诱导免疫细胞发生凋亡，调节机体免疫应答反应。越来越多的研究表明PD-1/PD-L1通路在肿瘤浸润和进展过程中发挥重要的作用，在多种恶性肿瘤中发现有PD-L1的过表达，而且还与肿瘤的恶性生物学行为及生存预后相关，是目前恶性肿瘤免疫治疗策略中的热门分子靶点。

本课题组前期实验也验证了在结直肠癌中PD-L1的过表达与肿瘤恶性生物学行为及患者的生存预后密切相关。为了进一步探索PD-L1对结直肠癌细胞生物学功能的影响，本课题组构建慢病毒转染系统下调PD-L1在直肠癌细胞系中的表达，然后进行一系列的分子生物学实验，研究下调PD-L1分子的表达对细胞生物学功能的影响，进一步阐明PD-L1分子在结直肠癌发生、发展中的作用和意义。结果表明下调PD-L1的表达，可以抑制癌细胞的高侵袭性，抑制细胞周期，促进癌细胞凋亡，降低结直肠癌细胞的体外增殖、侵袭和转移能力。综合目前已有的研究和本课题组研究成果，我们证明了下调PD-L1的表达能够抑制结直肠癌细胞生长，进一步论证了PD-L1能够直接影响肿瘤细胞恶性生物学功能，但其具体的信号传导通路及调控网络如何发挥作用有待进一步探讨。

最新研究发现，PD-1阻断剂对PD-L1过表达患者的治疗更加有效[11-13]。因此，阻断PD-1/PD-L1信号传导通路为肿瘤免疫治疗翻开了新篇章，其相关抗体及抑制剂在很多临床试验也取得了一定的研究成果，这为结直肠癌的治疗带来了曙光。

一般认为，PD-L1分子主要通过与受体PD-1结合后起到免疫抑制和免疫逃逸作用，其自身缺乏信号传导能力。Cao等发现，PD-L1可增强肿瘤细胞Slug和Twist的表达，抑制E-cad的表达，从而诱导上皮间质转化，促进肿瘤的发生[14]。而Hallett等结果显示，PD-L1分子可以不依赖于PD-1，自身作为功能分子，为肿瘤细胞传导生长抑制信号[15]。由此推测，PD-L1自身即可调控结直肠癌细胞的生物学功能，对抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤进展有重要作用。

PD-L1的表达调控通路在不同组织学类型的恶性肿瘤中可能不尽相同，正因如此，在肿瘤免疫治疗的临床试验中单一使用抗PD-L1抗体或抑制剂并不都能达到理想效果。进一步明确这些网络调控通路中的相关分子，联合抑制这些分子靶点可能会有更加明确的疗效。

综上所述，本研究显示，单独下调结直肠癌细胞中的PD-L1的表达，促进癌细胞凋亡，抑制癌细胞增殖、迁移和高侵袭性，降低癌细胞的恶性生物学行为。