Anti-miR34c树状纳米颗粒对裸鼠肝纤维化的治疗作用

张欢欢，方杰，俞文英，杨扬，余陈欢，应华忠

(浙江省医学科学院浙江省实验动物中心，浙江省实验动物与安全性研究重点实验室， 杭州 310013)

肝纤维化表现为肝内细胞间基质(ECM)蛋白过度表达和胶原沉积，是肝对各种因子刺激导致的慢性炎症进行异常修复的结果，如不及时治疗则会转变为不可逆的肝硬化，甚至发展为肝癌[1]。肝星状细胞(HSC)向成纤维样细胞转化，并合成细胞外基质蛋白，即肝星状细胞活化，是肝纤维化的“中心事件”。抑制HSC活化、增殖或者促进HSC凋亡能够逆转肝纤维化[2]。

MicroRNAs (miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小约20～25个核苷酸，通过转录后调控靶基因表达参与多种疾病的发生发展[3]。某些miRNAs参与调控肝纤维化及肝癌[4]，其中miR34c 在活化的HSC中表达上调[5]，并通过靶向肝星状细胞乙酰辅酶A合成酶长链家族成员(ACSL1)和过氧化物酶体增殖因子活化受体γ(PPARγ)基因参与肝纤维化[6-7]。miR34c表达上调与肝纤维化程度成正相关，下调其表达水平可能阻止或逆转肝纤维化发展。

树状大分子材料(dendrimer)为高度分支结构，具有很好的几何对称性和大量的表面官能团，并可通过端基改性来获得更多的功能性基团[8]。5代聚酰胺-胺(PAMAM)树状大分子携带正电荷，能够有效吸附带负电荷的microRNA并维持较好的3D构造，是理想的基因靶向治疗转染载体[9]。本研究应用四氯化碳诱导裸鼠肝纤维化模型，报道PAMAM包裹的anti-miR34c纳米颗粒能否达到逆转肝纤维化的效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

清洁级雄性裸鼠15只，体重(20±2)g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司【SCXK(沪)2013 - 0016】，饲养于浙江省医学科学院实验动物中心【SYXK(浙)2014 - 0008】。专用标准饲料、水喂养，所有操作均符合实验动物伦理学要求【伦理审批号：(2015)动伦审研第(06)号】。

1.1.2 药品与试剂

Anti-miR34c由广州锐博合成；PAMAM Dendrimer G5-NH2购自威海晨源分子新材料有限公司；四氯化碳和甲醛购自国药集团化学试剂有限公司；TGF-β和α-SAM抗体购自Abcam；血清AST、ALT、HA、ColIV、LN的ELISA试剂盒购自武汉博士德生物公司。

1.1.3 主要设备与仪器

马尔文纳米粒度电位仪，Zetasizer Nano ZS，英国；徕卡冰冻切片机， CM 1900，德国；徕卡荧光显微镜，DM2500，德国；MD多功能酶标仪，SpectraMax M4，美国。

1.2 方法

1.2.1 靶向miR34c树状纳米颗粒制备

anti-miR34c和PAMEM均用TE溶解，按照载体与DNA电荷比(N/P比)加入一定量的PAMAM，室温温育 20 min 后得到两者的自组装复合物。复合物中anti-miR34c终浓度为500 nmol/L，N/P比分别为5/1、15/1、20/1。马尔文纳米粒度电位仪测定纳米粒径、电位等。

1.2.2 动物模型建立、分组与给药

清洁级(20±2)g 雄性裸鼠，随机分为正常组、模型组、anti-miR34c树状纳米颗粒治疗组(治疗组)，每组5只。模型组和治疗组每周二、五注射20%四氯化碳100 μL，连续6周，正常组注射100 μL生理盐水。治疗组从第3周开始尾静脉注射200 μL anti-miR34c树状纳米颗粒，每周2次，在腹腔注射四氯化碳之前给药。

1.2.3 血清生化指标检测

体积分数3%戊巴比妥钠溶液麻醉裸鼠后，打开腹腔取主动脉血，离心分离血清，采用ELISA试剂盒检测AST、ALT、HA、ColIV、LN等指标。

1.2.4 肝组织病理观察

打开腹腔迅速取下肝组织并用4℃预冷的生理盐水反复洗净，滤纸吸干表面水迹，称湿重，按照肝组织湿重(g)/体重(g)×100%计算肝指数(g/g)。各组裸鼠取相同部位肝组织，10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，切片厚4～5 μm，进行HE染色和masson染色，观察肝组织病理和胶原沉积情况。

1.2.5 免疫组化检测肝组织TGF-β和α-SAM表达

肝组织常规石蜡包埋与切片，高温去蜡脱水，3% H2O2孵育25 min，灭活内源性酶，滴加正常山羊血清，室温孵育20 min。滴加TGF-β/α-SAM抗体(1∶200)， 4℃过夜，滴加生物素标记的二抗，37℃孵育30 min，滴加SABC，37℃孵育20 min，DAB显色，苏木素复染，二甲苯透明，树胶封片，显微镜下观察TGF-β/α-SAM表达情况。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Anti-miR34c树状纳米颗粒的制备

如表1 所示，anti-miR34c终浓度为500 nmol/L时，电位为正电荷，表明anti-miR34c电荷被完全中和，与PAMAM形成稳定复合物。N/P比为5/1粒径较为稳定，集中在650～720 nm之间，而N/P比越大，粒径大小越不稳定。聚合物分散指数(PDI，polymer dispersion index)越小，表面系统分散得越好，团聚的倾向越小。PDI小于0.2的树状纳米颗粒较为稳定，用于裸鼠肝纤维化治疗。

表1 不同氮磷比(N/P)anti-miR34c树状纳米颗粒粒径和zeta电位测定Table 1 Particle size and zeta potential of anti-miR34c and polyamidoamine complexes at different nitrogen/phosphorus(N/P) ratios

注：A. 肝指数，a/b/c表示各组数据P< 0.05。B. HE染色结果。C. masson染色结果。图1 anti-miR34c树状纳米颗粒对肝纤维化裸鼠肝组织病理的影响Note. (A) Liver index, significant differences between the groups a/b/c (P< 0.05). (B) HE staining. (C) Masson staining.Figure 1 Effects of anti-miR34c polyamidoamine nanoparticles on hepatic pathology in hepatic fibrosis of nude mice

2.2 Anti-miR34c树状纳米颗粒对肝纤维化裸鼠肝组织病理的影响

如图1A所示，正常对照组肝指数为(45±3.72)%，模型组升高到(66±2.90)%，差异有显著性(P< 0.05)，而anti-miR34c树状纳米颗粒治疗组为(52±5.66)%，与模型组比较肝指数降低，差异有显著性(P< 0.05)。HE染色结果显示(图1B)，正常对照组细胞排列均匀，无细胞间隙，也无炎症浸润，而模型组肝组织有明显的纤维包裹和脂质堆积，大量炎症细胞浸润，anti-miR34c治疗后肝组织与正常组相近，细胞排列整齐，无纤维索，无脂质堆积，masson染色结果(图1C)也显示治疗组胶原沉积明显减少，说明anti-miR34c能够有效改善裸鼠肝纤维化。

2.3 Anti-miR34c树状纳米颗粒对肝纤维化裸鼠血清生化指标的影响

如表2所示，模型组血清ALT和AST含量分别是对照组的3.6倍和10倍，差异有显著性(P< 0.05)，表明模型组肝损伤严重。血清HA、ColIV和LN水平也比对照组分别提高了120%、24%和61%，差异有显著性(P< 0.05)，说明模型组胶原沉积明显，纤维化水平较高。与模型组相比，anti-miR34c树状纳米颗粒治疗组血清AST、ALT、ColIV水平分别下调了61%、91%、19%，几乎达到正常对照组含量，差异有显著性(P< 0.05)，HA和LN也分别下调14%和3%，但差异无显著性。

表2 anti-miR34c树状纳米颗粒对血清生化指标的影响Table 2 Effects of anti-miR34c PAMAM nanoparticles on serum biochemical marker levels

注：血清生化指标，a/bP< 0.05。

Note. serum biochemical markers，a/bP< 0.05。

2.4 Anti-miR34c树状纳米颗粒对肝纤维化裸鼠肝组织TGF-β和α-SAM表达的影响

TGF-β是促进肝星状细胞活化并使之转化为成纤维状细胞的重要因子，肝组织免疫组化结果表明，与正常对照组相比，TGF-β在模型组的表达量显著升高，而在靶向miR34c树状纳米颗粒治疗组又比模型组明显降低。α-SAM主要表达于成纤维细胞样细胞中，是HSC活化的特征性蛋白，在正常对照组肝组织中表达很低，但是在纤维化模型组的纤维状病理损伤处大量表达，而在无明显纤维状损伤的治疗组中表达量下降(如图2)。

注：A. 各组裸鼠肝组织TGF-β免疫组化结果；B. 各组裸鼠肝组织α-SAM免疫组化结果。图2 anti-miR34c树状纳米颗粒对肝纤维化裸鼠肝组织TGF-β和α-SAM表达的影响Note. Immunohistochemistry for (A) TGF-β and (B) α-SAM in the liver.Figure 2 Effects of anti-miR34c PAMAM nanoparticles on liver transforming growth factor -β(TGF-β)/α-smooth muscle cell actin (α-SMA) levels

3 讨论

MiR34家族成员调节参与细胞周期、凋亡、分化和发育的多种基因表达[10]，其在多种肿瘤疾病中表达下调，被认为是抑癌因子[11]。但在多种肝疾病中miR34却表达上调，包括非酒精性脂肪肝、肝纤维化、肝癌等[12]。研究证实miR34可以靶向ACLS1蛋白参与HSC脂质代谢和细胞存活[6]，进而促进肝纤维化发展。其中miR34c也可以通过靶向调节PPARγ表达活化HSC[7]。因此，miR34c是治疗肝纤维化的潜在靶点。本研究给予肝纤维化裸鼠模型anti-miR34c树状纳米颗粒，有效减少了肝组织纤维样疤痕、减轻了胶原沉积，血清肝损伤生化指标ALT和AST以及胞外基质蛋白HA、ColIV和LN含量均下降，说明anti-miR34c树状纳米颗粒明显改善了裸鼠肝纤维化病理状态。

TGF-β是目前公认最重要的致纤维化细胞因子[13]，不仅能促进HSC的增殖及肝纤维化相关胶原的分泌，还可促进肝内各种细胞合成和分泌 TGF-β、EGF 等促纤维化细胞因子，进一步激活 HSC，促进ECM分泌[14]。α-SAM则是成纤维样细胞的标志蛋白，可以反映HSC活化。本研究肝组织TGF-β和α-SAM免疫组化结果显示，anti-miR34c树状纳米颗粒降低了肝组织TGF-β表达并抑制HSCs活化，逆转了四氯化碳造成的肝纤维化。

MicroRNAs带较强的负电荷并具有亲水性，很难进入细胞内，且在血管内很容易降解[15]，因此安全高效的输送载体尤为重要。PAMAM树状大分子是一类高度支化的单分散大分子，具有明显的分子结构特点[16]：(1)核心区；(2)向外延伸的树状分支；(3)表面携带大量的功能基团。5代PAMAM携带的正电荷能够与microRNA的负电荷相吸，使其稳定吸附于材料上。3D球面构型能够很好的保护microRNA在细胞内免受降解[9]，缓慢释放microRNA在靶细胞内长期作用。Ren等采用PAMAM将miR-21靶向胶质瘤细胞显著抑制其生长[17]，表明PAMAM是microRNA体外治疗的有效运送载体。本研究采用PAMAM 树状大分子将anti-miR34c输送到肝组织，实现肝纤维化的逆转，表明PAMAM也能够携microRNA进行体内治疗。