杜仲提取液对脂多糖诱导的乳腺炎小鼠疗效观察和作用途径

单旭菲，王建发，李启涛，贺显晶，郝丹丹，张旭，王海，武瑞

(黑龙江八一农垦大学 动物科技学院，黑龙江大庆 163319)

奶牛乳腺炎是奶牛乳腺的一种炎症反应，主要特点是乳汁的理化性质和细菌学变化以及乳腺组织的病理学变化，导致乳产量和质量降低[1]。存在治疗成本高、广泛流行等问题，严重影响患病动物的福利和健康[2]。多年以来，临床上对乳房炎的治疗主要采用抗生素疗法，初期取得了较好的效果，但随着时间的推移，导致病原菌产生耐药性以及机体内药物残留较多，危及机体健康。除此之外，疫苗防治效果不理想，也对乳房炎的防治提出了更高的挑战。因此，具有低毒性、低残留及安全性好等优势的中草药越来越受到科研工作者的青睐，越来越多的学者发现用中草药代替抗生素治疗奶牛乳房炎拥有良好的研究前景。

杜仲具有多种药理作用，其发挥作用的成分主要为绿原酸、黄酮类及多糖等。肖传明等研究发现由杜仲醇提物等一系列中草药植物组成的饲料添加剂能够有效地降低奶牛的体细胞数和乳房炎的发病率，还可以提高产奶量，具有无毒、无残留、稳定可靠等优点，符合畜禽产品安全生产规范。与此同时，我们发现在安全范围内加大杜仲剂量对奶牛乳房炎有明显的治疗效果。杜仲在当前的畜牧生产中虽然已有应用，但主要为粉剂，其吸收效果一般。本研究以杜仲提取液为研究对象，研究其对LPS诱导的乳腺炎小鼠的抗炎作用，为临床研究治疗奶牛乳腺炎提供理论依据，促进养殖业的健康持续发展。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

清洁级BALB/c小鼠104只， 6～8周龄，体重25～30 g，购自哈尔滨医科大学大庆校区实验动物中心【SCXK(黑)2013-001】，饲养于哈尔滨医科大学大庆校区实验动物中心【SYXK(黑)2013-001】，其中雌雄鼠比例为2∶1。

1.1.2 实验仪器

BPX-162电热恒温培养箱：宁波赛福实验仪器有限公司；KD-1508 A 轮转切片机：上海之信仪器有限公司；TEC2500病理组织漂烘处理仪：上海精密仪器仪表有限公司；CKX53生物显微镜：日本奥林巴斯公司；PT-3502G酶标仪：奥地利TECAN公司；组织匀浆器：德凡仪器有限公司；SC-2552低速离心机：上海奥豪斯有限公司；GMP-25平板摇床：上海巴玖实业有限公司。

1.1.3 实验药品

LPS(脂多糖)、TNF-α ELISA试剂盒等购自Sigma公司；甲醛、甲醇、乙醇、冰乙酸、正丁醇、苏木素、伊红、二甲苯、中性树胶、PBS等购自吉林省昊迪化学试剂经销有限责任公司；小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA检测试剂盒：美国eBioscince公司；杜仲提取液由本实验室提取。

1.2 实验方法

1.2.1 杜仲注射液的提取

将杜仲叶中的提取物中加入注射用水，使药液的浓度浓缩至2 g/mL。加入乙醇进行醇沉，剂量为使药液中乙醇浓度达到75%，避光密封放置4℃冰箱过夜，过滤，将醇沉后的药液浓缩到1.52 g/mL，加入明胶至不在产生沉淀，静置30 min，加入乙醇使乙醇药液浓度为80%，静置12 h，过滤离心，浓缩至1 g/mL。加入0.14%亚硫酸氢钠(W/V)和0.05%吐温-80(V/V)，调节pH值=5，加入0.2%药用活性炭(W/V)，45℃吸附25 min，首先进行0.45 μm微孔滤膜粗滤，在通过0.22 μm微孔滤膜精滤，最终得到杜仲注射液。杜仲注射液外观性状为棕黄色液体，提取物含量为1 g/mL，有效成分绿原酸含量大于等于8 mg/mL，无可见异物以及相关物质，符合《中国兽药典》(2010版二部附录)中热原检查、异常毒性检查、过敏检查以及溶血检查等安全性实验的相关规定。在相同的色谱条件下，供试品色谱图中出现了绿原酸色谱峰，出峰位置和保留时间与绿原酸标准品色谱峰相同，如下图1所示。

注：图A为绿原酸色谱图，图B为杜仲提取液色谱图。图1 绿原酸鉴别液相色谱图Note. (A) Chromatogram of chlorogenic acid. (B) Chromatogram of the extracted eucommia.Figure 1 Chlorogenic acid identification liquid chromatogram

1.2.2 建模与分组

将小鼠进行正常饲喂2～3 d，适应新的环境后，将雌雄鼠比例按照2∶1的关系进行分别合笼饲养，使其自然交配受孕。实验前2 h将上述泌乳雌鼠与雄鼠分开。通过微量注射器，将预实验筛选出的最佳剂量组50 μL浓度为0.2 mg/mL LPS通过乳导管缓慢匀速的注入小鼠乳腺中。

将实验用鼠分成6组，通过乳导管灌注50 μL浓度为0.2 mg/mL LPS构建小鼠乳腺炎模型，注射LPS 12 h后在腹腔注入不同浓度梯度的杜仲提取液，分为A、B、C、D、E、F 6组，A为对照组，B为LPS刺激组，C、D、E、F为给药组，给药剂量分别为13，20，27，33 mg/kg，每组各12只。

图2 肉眼观察剖检后乳腺变化Figure 2 Visual changes in the breast tissue at autopsy

1.2.3 样品采集及处理

在LPS刺激后12 h，进行杜仲提取液给药，12 h之后处死，剖检后，通过肉眼对空白对照组、LPS刺激组以及各实验组乳腺组织的病理特征变化进行仔细查看。将小鼠保定消毒。用灭菌的剪刀剪开腹部皮肤，采集第四对乳腺组织，在10% (v/v)甲醛溶液中将左侧剥离下来的乳腺进行组织固定，六个实验组均制作病理组织切片以便进一步观察炎症效果，采集到的右侧乳腺组织与PBS按照1∶9的比例研磨成匀浆液，离心后取上清液，按照ELISA试剂盒使用说明书操作，检测各组乳腺组织样品在450 nm处的OD值，依据数据绘制标准曲线，然后计算各个实验组中TNF-α、IL-6、IL-1β的相应浓度。每组样品均进行3次重复实验，取其平均值。

1.3 统计学方法

实验数据应用SPSS 19.0进行统计分析，当P< 0.05时表示差异有显著性，P< 0.01时表示差异有极显著性。

2 结果

2.1 肉眼观察剖检后乳腺变化

剖检后眼观乳腺组织病理变化如图2所示，空白对照组无病理特征变化，LPS刺激组小鼠的乳腺组织可见明显的充血、红肿等症状。与LPS刺激组对比，杜仲实验组小鼠的乳腺组织的上述症状明显减弱，并随着注射剂量的升高，症状缓解先逐渐加强后减弱，E组(27 mg/kg)接近正常。

2.2 乳腺组织病理组织学变化

实验各组乳腺组织切片经HE染色结果如下图所示，其中A组无病理变化且腺泡结构完整，B组中腺泡壁有明显水肿，腺泡中出现大量嗜中性粒细胞等浸润物。与B组对比，其余四组小鼠的乳腺组织损伤程度较轻，组织中腺泡结构相对比较完整，腺泡壁水肿现象有所缓解，嗜中性粒细胞等浸润物较少，E组(27 mg/kg)乳腺组织炎症的损伤起到更加显著的抑制作用。

2.3 乳腺组织中主要炎性细胞因子含量变化

由图4可见，与A组相比，B组乳腺组织中炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平极显著的升高(#P< 0.01)。如图5所示，C、D、E、F对乳腺组织中主要炎性细胞因子表达含量具有明显的抑制作用，在杜仲提取液E组(27 mg/kg)的抑制效果最佳。

注：#P< 0.01表示差异极显著。图4 乳腺组织TNF-α含量Note. #P< 0.01indicates that the difference is extremely significant.Figure 4 Tumor necrosis factor alpha (TNF-α) content in the breast tissue

注：A为对照组，B为LPS刺激组，C、D、E、F为给药组，剂量分别为13，20，27及33 mg/kg。与空白对照组相比，#P< 0.01。与B组相比，*P< 0.05或**P< 0.01。图5 乳腺组织中主要细胞因子含量的变化Note:(A) Control group. (B) LPS group. (C-F) Du Zhong treatment groups at 13, 20, 27, and 33 mg/kg, respectively. Compared with the control group, #P< 0.01. Compared with B group, *P < 0.05, **P< 0.01.Figure 5 Changes of major cytokines in the breast tissue

3 讨论

在以往的研究中，用奶牛作为模型动物进行研究成本过高、且操作困难。研究还发现以奶山羊作为模型动物成功率较大，其乳腺炎发病率和临床症状均与奶牛相近，且具有高产奶量、高繁殖率、生长快等优点，但因购买奶山羊成本较高、实验操作复杂而难以作为动物乳腺炎模型进行大量实验[3]。因此构建一种成本较低、操作简单乳腺炎动物模型替代大型的动物进行前期的实验，不仅可以为乳腺炎的研究提供基础，还可以对乳腺炎的治疗途径起到积极的推进作用。从1970年起，Chandler首次成功建立小鼠乳腺炎模型用于乳房炎的研究[4]。有学者研究表明，经乳导管注入内毒素，可成功诱发大鼠急性乳腺炎[5]。目前，研究奶牛乳腺炎免疫机制、发病机理最常用、高效的动物模型依然是构建小鼠乳腺炎模型[6-7]。本研究建立的乳腺炎模型从眼观、切片和炎症细胞因子表达方面的变化均与奶牛乳腺炎一致，用杜仲提取液治疗后效果明显，且小鼠无明显不良反应，提示可根据小鼠和奶牛的生物等效性换算标准推测一个适宜的用药浓度，为奶牛乳腺炎的临床治疗研究提供参考。

杜仲中含有环烯醚萜类、杜仲胶、木脂素类、苯丙素类等多种功效成分，其中绿原酸、桃叶珊瑚苷以及黄酮类等多种化合物有抗炎、抗病毒和降血压等作用。绿原酸是由咖啡酸和奎宁酸醋化形成的具有天然结构的化合物，有研究报道其对多种病原菌都有很好的抗菌消炎作用[8-9]。本研究结果表明杜仲提取液治疗后可有效降低乳腺组织炎症细胞因子及中性粒细胞数量，我们推测可能是由于杜仲提取液中的生物活性成分绿原酸降低了LPS诱导的小鼠乳腺上皮细胞炎症反应，阻断了中性粒细胞向乳腺组织和乳腺腺泡腔募集和迁移过程[10-11]。实验结果表明使用杜仲提取液治疗后能够显著降低嗜中性粒细胞的数量，尤其是E组(27 mg/kg)效果更佳，表明了杜仲提取液对小鼠乳腺炎症的缓解具有剂量依赖性，能够通过抑制炎性信号通路的活化而降低IL-1β、IL-6和TNF-α等主要炎性细胞因子的转录，起到显著缓解乳腺组织的病理损伤程度，进而达到抗炎的目的。而当药物作用浓度高于E组时，抑制作用减弱，可能是由于过多的绿原酸对机体本身产生毒性作用，因此导致抑制作用的减弱，具体机制有待进一步研究。