食品中沙门氏菌检测方法比较

程 浩

(安徽省食品药品检验研究院，安徽合肥 230051)

沙门氏菌(Salmonella)是一种常见的食源性致病菌，主要寄生于人类和动物肠道传染致病，可致肠热症、慢性肠炎、食物中毒等[1]。由于沙门氏菌经常存活于肉制品、蛋类、水产品中，故世界各国普遍规定食品中不得检出沙门氏菌。据统计，我国细菌性食物中毒中70%～80%是由沙门氏菌引起，人一旦摄入含有大量沙门氏菌(106～107个/g)的动物性产品，就会引起细菌性感染，进而在毒素作用下发生食物中毒导致胃肠炎、伤寒和副伤寒，且沙门氏菌的传播媒介众多，肉、蛋以及食品从加工到出售的过程中都十分容易发生污染[2-3]，因此对沙门氏菌的检验事关重大。目前常用的检测方法有传统方法(如国家标准、行业标准、FDA、AOAC、FSIS、ISO、加拿大官方食品微生物分析方法)、仪器检测法(如VIDAS、BAX)、商品化生化鉴定系统(VITEK GNI+、API 20E)[4-5]。笔者分别采用国标GB4789.4—2016、基于迪澳生物核酸恒温扩增荧光检测技术的致病菌快速检测系统、MICRO FAST沙门氏菌快速检测卡的方法检测食品中的沙门氏菌，比较3种检测方法的检测效果和检出率。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1试验阳性菌种。肠炎沙门氏菌(CICC21513)来自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2国标GB4789.4—2016方法。缓冲蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸钠亮绿培养基(TTB)、亚酸盐胱氨酸增菌液(SC)、亚硫酸铋琼脂(BS)、三糖铁琼脂(TSI)、XLD培养基、HE培养基、沙门显色培养基、沙门氏菌生化鉴定试剂盒、沙门氏菌O多价抗原、H多价抗原均来自北京陆桥技术有限责任公司。

1.1.3基于迪澳生物核酸恒温扩增荧光检测技术的致病菌快速检测系统。致病菌核酸恒温扩增荧光检测仪、移液器、混匀器、恒温金属浴、高速离心机、迪澳沙门氏菌核酸检测系列试剂盒均由广州迪澳生物科技有限公司提供。

1.1.4MICRO FAST沙门氏菌快速检测卡。快速检测卡由北京良润生物科技有限公司提供。

1.2测试步骤

1.2.1国标GB 4789.4—2016方法[6]。取检样25 g，加入225 mL缓冲蛋白胨水于均质袋内，均质后于(36±1)℃培养24 h，然后分别移取1 mL转种于10 mL四硫磺酸钠亮绿培养基(TTB)，于42 ℃培养18～24 h；同时，另取1 mL转种于10 mL 亚酸盐胱氨酸增菌液(SC)内，于(36±1)℃培养18～24 h。取增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂(BS)、XLD培养基、HE培养基、沙门显色培养基上，于(36±1)℃分别培养18～24 h或40～48 h(BS)；观察在各培养基上的菌落形态，如发现疑似菌，纯化后做生理生化鉴定。

1.2.2基于迪澳生物核酸恒温扩增荧光检测技术的致病菌快速检测系统[7-8]。取检样25 g，加入225 mL缓冲蛋白胨水于均质袋内，均质后于(36±1)℃培养24 h得增菌液。用快速提取试剂盒提取增菌液中沙门氏菌的核酸，将处理液滴加于检测试剂中混匀，使用迪澳恒温PCR检测仪进行检测，自动判读结果。

1.2.3MICRO FAST沙门氏菌快速检测卡[9]。取检样25 g，加入225 mL缓冲蛋白胨水于均质袋内，均质后于(36±1)℃培养24 h得增菌液。移取1 mL增菌液到无菌试管中，于沸水中加热10 min，冷却后使用。打开检测卡，在加样孔中垂直滴加3～4滴(约100 μL)已灭菌的待检样品，等待8～10 min后，观察检测卡中部的检视窗的结果。30 min后显示结果无效。阳性反应：C、T线均显色。阴性反应：C线显色，T线不显色。失效反应：C线不显色，测试失败或检测卡失效。

2 结果与分析

2.1传统检测方法检测结果检测的63份食品样品中，通过传统国际GB4789.4—2016方法检测，共检出阳性样品2份。2份样品经前增菌、増菌、分离纯化后的菌种在培养基上的形态符合沙门氏菌，其生理生化试验以及血清凝集试验均满足沙门氏菌的性状，判定检测结果阳性。

2.2快速检测方法结果基于迪澳生物核酸恒温扩增荧光检测技术的致病菌快速检测系统和MICRO FAST沙门氏菌快速检测卡的方法都检出了3份阳性样品。

2.3检测结果的比较从表1可看出，检测的63份食品样品中，用传统国标GB 4789.4—2016方法检出2份阳性样品，检出率3.2%；而基于迪澳生物核酸恒温扩增荧光检测技术的致病菌快速检测系统和MICRO FAST沙门氏菌快速检测卡的方法均检出了3份阳性样品，检出率均为4.8%。由此可见，基于迪澳生物核酸恒温扩增荧光检测技术的致病菌快速检测系统和MICRO FAST沙门氏菌快速检测卡的方法与传统国标方法相比较具有较高的灵敏性和特异性。

表1 3种检测方法检测结果比较

2.4检测方法优缺点比较从表2可以看出，3种检测方法各有优缺点，基于迪澳生物核酸恒温扩增荧光检测技术的致病菌快速检测系统和MICRO FAST沙门氏菌快速检测卡的方法与传统国标方法相比较具有操作方便、快速灵敏的优点，可以用于大批量食品中沙门氏菌的快速检测和初筛；而国标GB 4789.4—2016方法在国际上被广泛承认，是鉴定沙门氏菌的基准方法。

表2 3种检测方法优缺点比较

2.5对于国标中沙门氏菌检测过程的思考

(1)前增菌和二次增菌都是必不可少的过程。食品中的沙门氏菌含量一般都很少并且会有多种细菌同时存在的情况，前增菌可以使受伤菌得到修复而增菌可以抑制一些杂菌的生长，所以用前增菌和增菌分别进行筛选和培养，可以增加后期分离培养的检出率。

(2)分离培养中应注意当不存在典型的或可疑的沙门氏菌菌落时，按如下步骤检验非典型的沙门氏菌菌落：①HE和XLD。非典型的沙门氏菌在HE和XLD琼脂上呈黄色菌落，带或不带黑色中心。HE和XLD平板经(24±2)h培养后，没有典型的沙门氏菌菌落，则挑取2个或更多个非典型的沙门氏菌菌落。②BS琼脂。某些非典型菌株产生绿色菌落，其周围培养基稍微或不呈暗色。如果BS平板培养(24±2)h后，没有出现典型菌落，则不挑取任何菌落让平板继续培养(24±2)h。如果经(48±2)h培养后，仍没有典型或可疑菌落出现，则挑取2个或更多个非典型的菌落。

(3)TSI要制备成高柱斜面，有助于结果判读，试验时应先划线再穿刺，先穿刺再划线会由于含菌量太高，如果产H2S变黑，难以观察底层的产酸现象，并且如果产气较多的话培养基会被顶出很高更有甚者可能会顶开试管塞。典型沙门氏菌在TSI上斜面呈红色，底端呈黄色，有气体产生，90%形成H2S，琼脂变黑。但对于乳糖阳性的沙门氏菌斜面也呈黄色，因此不能仅仅根据三糖铁培养的结果就确认沙门氏菌。

(4)目前没有一种培养基能准确无误地筛选出沙门氏菌，因此必须选择多种选择性培养基同时进行筛选，显色培养基只是综合选择性更强，试验人员不能只在选择性培养基和TSI 特征符合而没有把关键的生化反应和血清学鉴定完成的情况下就报结果，这样很可能导致结果假阳性。

(5)血清学鉴定是沙门氏菌检验中的重要鉴定方法，包括菌体抗原(O)鉴定、鞭毛抗原(H)鉴定和Vi抗原鉴定。血清检测时要使用24 h内的纯菌，在规定时间内观察结果，并做自凝试验。凝集不好的室温(不要放冰箱)放置1～2 d或者传代一次再凝集，可能凝集的情况会好些。如果实验室条件许可建议购置进口血清(以泰国和丹麦血清为佳)，如果用国产血清尽量同时使用2种厂家产品互相验证。

(6)沙门氏菌结果判定应该以生化试验结果为主，并在此基础上进行血清学判定。直接用多价血清进行试验而不进行生化试验是绝对不可取的。因为血清学的原理是抗原抗体结合，非沙门氏菌的微生物也有可能带有沙门的类似抗原，这样的操作可能会导致假阳性，因此在做鉴定时必须先进行生化试验，再在生化试验的基础上进行血清学鉴定。

(7)如果只需要鉴定某个菌株是否属于沙门氏菌，那只需要做O多价和H多价血清就可以了(大多数食源性沙门氏菌凝集A-F群O多价)。如果要鉴定某个菌株具体是什么沙门氏菌，那就需要进行血清学分型试验，从多价血清一直做到O抗原和H抗原的单因子，然后参照《GB 4789.4—2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》附录B的表格查找对应的沙门氏菌名。

(8)在做血清学鉴定时，O多价血清如果没有凝集并不能直接判定为阴性，因为还要考虑Vi抗原的影响。Vi抗原属于K抗原群会阻隔O抗原和相应抗体的结合，所以当Vi抗原存在时，O多价血清是不会凝集的，因此必须去除Vi抗原的影响。具体方法是挑取菌苔于1 mL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查如果还是不凝集，才能判定为阴性。

3 结论与讨论

该研究分别采用国标GB 4789.4—2016、基于迪澳生物核酸恒温扩增荧光检测技术的致病菌快速检测系统、MICRO FAST沙门氏菌快速检测卡的方法检测食品中的沙门氏菌，比较3种检测方法的检测效果和检出率。结果显示，检测的63份食品样品中，用国标GB 4789.4—2016方法检出2份阳性样品，检出率3.2%，检测时间至少为6 d；而基于迪澳生物核酸恒温扩增荧光检测技术的致病菌快速检测系统和MICRO FAST沙门氏菌快速检测卡的方法均检出了3份阳性样品，检出率均为4.8%，并且可以在30 h内出结果。从灵敏度和特异性角度来看，基于迪澳生物核酸恒温扩增荧光检测技术的致病菌快速检测系统和MICRO FAST沙门氏菌快速检测卡的方法与传统国标方法相比较具有快速灵敏的优点；从检测周期来看，国标GB 4789.4—2016微生物培养法中培养时间较长，最短的检测周期为6 d，而基于迪澳生物核酸恒温扩增荧光检测技术的致病菌快速检测系统和MICRO FAST沙门氏菌快速检测卡的方法2 d即可出结果，可以用于大批量食品中沙门氏菌的快速检测和初筛，也可以作为国标方法的有效补充。