基于网络药理学的苦丁茶主要活性成分及药理作用机制分析

霍丽妮，陈 睿，钟振国*，李培源，卢澄生

(1.广州中医药大学，广东广州 510006；2.广西中医药大学，广西南宁 530001)

苦丁茶(IlexKudingchaC.J.Tsing)是冬青科冬青属苦丁茶种常绿乔木，俗称菠萝树、大叶茶和茶丁等，是我国南部及西南部民间传统的药用植物，具有清热解毒、杀菌消炎、健胃消积、止咳化痰、生津止渴、提神醒脑、明目益智和抗辐射、抗衰老、活血脉、调节血脂等功效[1]，素有“保健茶”“美容茶”“减肥茶”“降压茶”“益寿茶”等美称，可作为新型保健药开发，具有很广阔的前景。苦丁茶化学成分较复杂，主要含有三萜及苷类、黄酮类、多酚类、氨基酸、挥发油以及多糖等多种有效物质成分[2]。因中草药具有多成分、多靶点及相互协同等特点，导致研究苦丁茶活性成分及潜在的药用靶点存在很大困难。

2007年Hopkins提出网络药理学理论[3]，它是基于系统生物学的理论，对生物系统的网络分析，选取特定信号节点(Nodes)进行多靶点药物分子设计的新学科。网络药理学强调药物也可以是多成分-多靶标-多疾病的作用方式，通过对信号通路的多途径调节，提高药物的治疗效果，降低毒副作用，从而提高新药临床试验的成功率，节省药物的研发费用。目前，已有学者将网络药理学用于预测和辨识中药活性成分群、作用靶点及阐明作用机制[4]。因此，笔者基于TCMSP数据库，运用网络药理学方法，建立药物-靶点-疾病网络，结合基因本体GO(gene ontology)和生物通路(pathway)功能富集分析，对活性成分的作用靶点、相关疾病以及生物通路等进行综合分析，以期揭示苦丁茶的主要活性成分及其药理作用机制。

1 材料与方法

1.1化学成分收集与活性成分筛选采用TCMSP数据库，通过TCMSP数据库收集苦丁茶的化学成分，共收集苦丁茶化学成分94个。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和类药性(drug-like，DL)评价成分的体内过程，选择OB≥28%和DL≥0.18 作为筛选条件，筛选活性成分。

1.2活性成分与靶点的作用数据收集根据筛选得出的活性成分在TCMSP平台中找出相对应的靶点，将靶点数据进一步通过UniProt数据库、TTD、drugbank数据库确认。选择物种为人(Human)作为研究对象，最终得到苦丁茶活性成分的作用靶点182个。

1.3网络构建和分析使用可以图形化显示并可进行分析和编辑的软件Cytoscape(版本3.6.1)，将候选化合物与其潜在的靶点蛋白生成一个体现药物靶点相互作用的网络图，并根据得出的潜在靶点在TCMSP平台中找出相关的疾病(种)，生成靶点疾病相互作用网络图，进而可生成化合物疾病相互作用网络图。

1.4GO及pathway富集分析为了揭示互作蛋白在基因功能上的富集情况，将CTD在线分析平台筛选182个靶点蛋白导入Funrich软件(版本3.1.3)，通过软件的Gene enrichment模块进行 GO及 pathway 富集分析。

2 结果与分析

2.1活性化合物筛选如表1所示，以OB≥28%和DL≥0.18作为筛选条件得到13个活性成分。

表1 苦丁茶的活性化合物

2.2活性成分-靶点网络分析将筛选出的13个活性成分和靶点相连构建活性成分-靶点(components-targets，C-T)网络图，如图1所示，其中包含191个节点nodes(9个活性成分和182个靶点)；V形节点代表活性成分，圆形节点节点代表靶点，而边则表示活性成分与靶点的相互作用关系。在网络中，节点的网络度和介数值与节点的重要性成正比，节点的大小也反映度的大小，如表2所示，其中黄酮类MOL000098(槲皮素)度数最大(154个靶点)，为网络的中心节点；其次是黄酮类MOL000422(山柰酚)有63个靶点、萜类MOL000358(β-谷甾醇)有38个靶点、黄酮类MOL006505(表儿茶素)有32个靶点。靶点较多的成分可能在苦丁茶发挥药理功能中起重要作用，从表2可以看出苦丁茶的良好生物活性主要与黄酮类化合物或萜类有关。文献报道也验证了预测结果，黄酮类化合物槲皮素、山柰酚、表儿茶素均被证明具有降压、降血脂、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等作用[5-8]，此外，β-谷甾醇也被证明具有抗菌、抗炎、抗癌、抗氧化、抗高血脂、抗动脉硬化、抑制血小板聚集等广泛的药理活性[9]。

在靶点上，G1氨基丁酸A型受体α1(GBRA1)、前列腺素H2(PGH2)、重组蛋白PKAca、前列腺素H1(PGH1)、类固醇受体激活蛋白2(NCOA2)、热休克蛋白90B(HS90B)、重组人胱天蛋白酶(CASP3)的度值较高，它们分别与7、6、5、5、5、5、5个活性化合物相互作用(图1和表2)，表明活性成分在靶点上具有协同性，是苦丁茶发挥整体药效作用的关键靶标。在靶点数目上，以黄酮类活性成分靶点最多(220个)，其次是萜类(44个)和酚类(43个)，说明这些成分之间有着较强的协同作用，故而贡献多维药理活性。

表2 苦丁茶中的化学成分-靶向蛋白的网络度和介数值

2.3靶点-疾病及主要活性成分-疾病网络分析通过CTD在线分析平台将筛选182个靶点与疾病相连接构建靶点-疾病(targets-diseases，T-D)网络图，如图2所示，其中包含348个节点nodes(82个蛋白靶点和266种疾病)。266种疾病中主要包括肿瘤(50种)、心脑血管疾病(49种)、炎症(19种)和微生物感染(10种)等几大类。

为了直观地反映活性成分与疾病之间的关系，选择相关度高的活性化合物和靶点与相关疾病构建C-T-D网络(疾病节点只显示degree≥6)。从图3可以看到有超过50%的疾病与肿瘤、炎症和心脑血管疾病相关。目前，苦丁茶已被证实可治疗原发性高血压及心脑血管疾病等的头昏、头痛、胸闷、乏力、失眠，降低血压、血脂，改善血液流变学状态的作用，具有很好的开发利用前景[10]。研究表明，苦丁茶具有较好的体外抗MCF-7人乳腺癌细胞活性，其水提物(200 μg/mL)抑制率达81%，并且研究还发现能减弱炎症相关因子NF-kB、iNOS和COX-2的表达，展现了良好的抗炎特性[11]。此外，苦丁茶黄酮还可通过caspases活化诱导人HSC-3口腔癌细胞凋亡[12]。这些研究均与网络分析的结果一致。

2.4通路富集分析和构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络将CTD在线分析平台筛选182个靶点蛋白导入Funrich软件进行了GO和pathway富集分析。GO可分为分子功能、生物过程和细胞组成3个部分。GO富集分析可以粗略了解差异基因富集在哪些生物学功能、途径或者细胞定位，通过GO富集分析(P<0.05)，如图4所示，分子功能、细胞组分及生物过程3个部分分别显著富集到20、65和13个条目。分析结果表明，其分子功能与氧化还原酶活性和细胞因子活性相关性最大；细胞组分与细胞外隙和细胞外基质相关性最大；生物过程与能量途经和新陈代谢相关性最大。

图1 苦丁茶中的活性成分-靶点网络图Fig.1 The components-targets network

图2 靶点-疾病网络图Fig.2 The targets-diseases network

对差异基因进行pathway分析，可以了解试验条件下显著改变的代谢通路，在机制研究中显得尤为重要。通过pathway分析(P<0.01)，富集到283条pathway，图5显示最为显著的6条pathway分析结果，包括AP-1转录因子网络、整合素连接激酶信号、由VEGFR1 and VEGFR2介导的信号事件、VEGF and VEGFR信号网络、LKB1 信号事件以及IFN-γ通路。这些信号通路与乳腺癌、黑色素瘤等癌症以及心脑血管疾病有密切关系。

图4 基因本体富集分析Fig.4 Enrichment analysis by gene ontology

图5 生物通路富集分析Fig.5 Enrichment analysis by biological pathway

3 结论

综上所述，该研究应用网络药理学方法初步研究了苦丁茶的活性成分、靶点、相关疾病及其疾病系统和作用生物通路，共发现苦丁茶活性成分共13个，进一步通过网络分析筛选，得到9个主要活性成分，作用靶点182个，关联通路6条，治疗疾病262种，主要用于治疗癌症、炎症、心脑血管等疾病，由此可见苦丁茶治疗疾病的广泛性，具有多成分-多靶标-多通路的特点。靶点GBRA1、PGH2、PKAca、PGH1、NCOA2、HS90B、CASP3互作的相关活性成分较多，可能是苦丁茶活性成分发挥药效作用的关键靶标。相关的通路均与癌症和心脑血管疾病有关。这些研究结果从网络药理学角度揭示了苦丁茶的主要活性成分及其作用靶点、主要疾病类型及关键生物通路，为进一步研究其药理作用机制奠定了良好基础。