离子液体—超声辅助—固相萃取法提取富集急性子药材中的4种凤仙萜四醇皂苷

吴谦 林花 刘迎 金永日 黎鹏 刘伟杰 李绪文

摘 要 建立了一种绿色、快速、高效萃取和富集中药急性子中4种凤仙萜四醇皂苷的方法。采用离子液体并结合超声辅助萃取急性子中的化学成分，利用固相萃取小柱富集提取液中的凤仙萜四醇皂苷。通过考察离子液体种类及用量、pH值、超声时间、固相萃取剂和洗脱剂等实验条件对提取率的影响，确立了最优萃取剂为[C6mim]Br，最优萃取条件： 萃取剂用量为0.9 mL，提取液pH=7.0，超声为30 min，最优富集条件： 固相萃取小柱填料为0.9 g CHP20/P120，上样流速为1.5 mL/min，洗脱剂为1.5 mL甲醇。在最优条件下，4种凤仙萜四醇苷加标回收率在92.1%～108.2%之间，相关系数范围为0.9945～0.9975，检出限范围为1.8～4.5 μg/mL， RSD<3.9%。本方法与传统回流提取方法提取效果接近，可准确测定急性子中4种凤仙萜四醇苷含量。

关键词 离子液体； 固相萃取； 急性子； 凤仙萜四醇皂苷； 超声辅助

1 引 言

急性子为凤仙花属植物凤仙花Impatiens balsamina L.的干燥成熟种子。在临床上可用于避孕[1]、终止早孕及治疗梗阻[2]、癌症及骨质增生[3]。研究表明，急性子中主要活性成分包括皂苷[4]、黄酮[5]、萘醌[6]、挥发油[7]和多糖[8]等。其中，2015版《中国药典》以凤仙萜四醇苷A与凤仙萜四醇苷K的含量之和大于0.2%作为急性子药材的质量标准[9]。

凤仙萜四醇皂苷属于Baccharane型皂苷，具有抗肿瘤及抗风湿作用[10，11]。由于凤仙萜四醇皂苷无紫外吸收，因此现有的皂苷含量测定以高效液相色谱-蒸发光检测器（HPLC-ELSD）法为主要测量手段。谭丽娜等[12]利用HPLC-ELSD法测定了急性子中凤仙萜四醇苷A和凤仙萜四醇苷K的含量，Li等[13]通过HPLC-ESI-MSD 及 HPLC-ELSD法测定了急性子中8种凤仙萜四醇苷。而这些含量测定中所使用的提取方法均为回流法。尽管该方法提取过程操作较为简单，但存在着提取周期长、有机试剂用量大、皂苷提取与富集率低等缺點。因此，亟待研发一种快速、高效、绿色的凤仙萜四醇皂苷提取方法。

离子液体是指在室温下完全由离子组成的有机液体物质。由于其呈液态的温度范围宽，对有机物具有较好的溶解性能，在天然产物提取中有着广泛应用。文献已报道过利用离子液体萃取萜类[14]、黄酮类[15]、生物碱类[16]、类脂类[17]等天然产物中的有效成分。近年来，于秀培等[18]建立了分散液-液微萃取测定藿香正气口服液中厚朴酚及和厚朴酚含量的方法，Xu等[19]建立了离子液体-超声辅助-分散固相微萃取测定了天然色素类化合物的方法。此类离子液体与固相萃取、液-液萃取[20]、液相微萃取[21]、离子液体/超临界萃取[22]等多种富集手段的联用，进一步拓展其在天然产物成分含量分析中的应用[23]。与传统的提取方法相比，离子液体联用技术不仅能够有效富集天然产物中活性成分，更简化了实验步骤，减少了有机试剂使用量及环境污染。

采用离子液体超声辅助提取及固相萃取联用作为提取方法，结合HPLC-ELSD法测定了急性子药材中4种主要的凤仙萜四醇苷A、B、K、M的含量，通过考察影响提取率的主要因素，确立了最佳提取条件。本方法具有简单、分析速度快的优点，为急性子乃至其它中药材中活性成分的分析提供了新思路。

2.2 实验方法

2.2.1 离子液体-超声辅助-固相萃取法 准确称取急性子干燥药材粉末（过60目筛）0.1 g，加入2.5 mL水和0.9 mL [C6min]Br，涡旋振荡提取30 s，放入超声清洗器中，在250 W功率下超声30 min，提取液以1.5 mL/min流速吸附于填有0.9 g CHP20/P120大孔树脂固相萃取小柱，用1.5 mL甲醇洗脱，减压蒸馏回收提取液，并以甲醇准确定容至1 mL，经0.22 μm滤膜过滤后，吸取20 μL续滤液注入高效液相色谱测定，平行测定3次。

2.2.2 回流提取法 准确称取急性子干燥药材粉末（过60目筛）0.1 g， 80%乙醇溶液回流提取2次，减压蒸馏回收洗脱液并以甲醇准确定容至1 mL，经0.22 μm滤膜过滤后，吸取20 μL续滤液注入高效液相色谱测定，平行测定3次。

2.2.3 标准溶液的配制 分别准确称取凤仙萜四醇苷A、B、K、M 各1.0 mg，用2.5 mL水溶解，加入0.9 mL [C6mim]Br离子液体，涡旋30 s，超声30 min后，以1.5 mL/min上样流速经0.9 g CHP20/P120型大孔树脂SPE柱吸附。以1.5 mL甲醇洗脱，减压蒸馏回收洗脱液，并以甲醇准确定容至1 mL，再逐级稀释成系列标准溶液。

2.2.4 色谱条件 色谱柱： Tnature C18色谱柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm，华谱新创科技有限公司）； 流动相： 甲醇（A）-水（B）。梯度洗脱条件： 0～16 min， 50% A；16～20 min， 45% A， 20～23 min， 50% A； 23～27 min， 55% A； 27～35 min， 60% A； 35～40 min， 55% A； 40～50 min， 70% A； 50～60 min， 80% A； 60～70 min， 90% A。柱温： 30℃； 流速： 1.0 mL/min； 进样体积： 20.0 μL。

2.2.5 ELSD检测条件 载气： 空气； 载气压力： 2.6 bar； 漂移管温度： 102℃。

3.4 急性子药材中4种凤仙萜四醇苷含量的测定

分别利用本研究建立的提取方法与乙醇回流提取方法制备了样品溶液，并测定了4份市售急性子中4种凤仙萜四醇苷的含量，标准溶液与样品溶液色谱图见图6，实验结果列于表3。结果表明，本实验方法与乙醇回流提取的含量测定的结果差异较小，说明本方法与传统提取方法的提取效果相差较小，可准确测定急性子中4种凤仙萜四醇皂苷的含量。

4 结 论

建立了一种超声辅助-离子液体-固相萃取法萃取并富集急性子药材中凤仙萜四醇苷类成分的新方法。本样品前处理方法减小了萃取剂用量，并具有较好回收率。本方法具有快速、高效、环保、准确等优点，为急性子药材质量控制提供了新的样品前处理方法，也为中药材及其制剂中功效成分的提取与富集新方法的探究提供了有价值的参考。

References

1 WANG Yu-Sheng. Chinese Pharmacological and Application. Beijing： People's Health Publishing House， 1983： 799

王浴生. 中药药理与应用. 北京： 人民卫生出版社， 1983： 799

2 ZHAO Liang-Qian. Jiangsu J. Tradit. Chin. Med.， 2002， 23（9）： 25

赵良倩. 江苏中医药， 2002， 23（9）： 25

3 MA You-Yun. Shanghai J. Tradit. Chin. Med.， 2007， 41（1）： 78

马有运. 上海中医药杂志， 2007， 41（1）： 78

4 Fu Y， Gao W， Yu J J， Chen J， Li H J， Li P. J. Pharmaceut. Biomed.， 2012 ， 64-65（4）： 64-71

5 WANG Wei， JU Cheng-Guo， ZHU Xu， ZHAO Huan-Jun. Chin. Tradit. Pat. Med. ， 2011， 33（2）： 199-202

王 巍， 鞠成国， 朱 旭， 赵焕君. 中成药， 2011， 33（2）： 199-202

6 Wang Y C， Lin Y H. Fitoterapia. 2012， 83（8）： 1336-1344

7 CHEN Ming-Xia， WANG Xiang-Li， ZHANG Yu-Jie. Chin. J. Chin. Mater. Med.， 2006， 31（11）： 928-929

陈明霞， 王相立， 张玉杰. 中国中药杂志， 2006， 31（11）： 928-929

8 TONG Miao-Miao， ZHAI Yan-Jun， WANG Tian-Min， LI Na. Chin. Tradit. Pat. Med. 2011， 33（7）： 1171-1174

佟苗苗， 翟延君， 王添敏， 李 娜. 中成药， 2011， 33（7）： 1171-1174

9 Chinese Pharmacopoeia Commission， Chinese Pharmacopoeia， vol. I， Beijing ： The Medicine Science and Technology， 2015： 263

中华人民共和国药典（一部）. 国家药典委员会. 北京： 中国医药科技出版社， 2015： 263

10 Wu Q， Jin Y R， Yao H， Liu Y， Li P， Li X W. Chem. Res. Chinese U.， 2017， （5）： 1-5

11 LI Hui-Jun， YU Jun-Jie， LI Ping. China Patent， 201010126336.4， 2012

李会军， 于俊杰， 李 萍. 中国专利， 201010126336.4， 2012

12 TAN Li-Na， LU Juan， ZHU Na， MENG Lei， ZHU Hong-Wei， LIU Yu-Wei， JIN Yong-Ri， LI Xu-Wen. Chin. J. Pharm. Anal.， 2009， 29（5）： 717-720

谭丽娜， 陆 娟， 朱 娜， 孟 磊， 朱红微， 刘玉玮， 金永日， 李绪文. 药物分析杂志， 2009， 29（5）： 717-720

13 Li H J， Yu J J， Li P. J. Pharmaceut. Biomed.， 2011， 54（4）： 674-680

14 Sara L， Héctor R， Alberto A， Ana S. Fluid Phase Equilibr.， 2014， 361（2）： 37-44

15 Xu W， Chu K D， Li H， Zhang Y Q， Zheng H Y， Chen R L， Chen L D. Molecules， 2012， 17（12）： 14323-14335

16 Ana F MCláudio， Ana M F， Mara G F， Joo A P C. Green Chem.， 2013， 15（7）： 2002-2010

17 Choi S A， Lee J S， Oh Y K， Jeong M J， Kim S W， Park J Y. Algal Res.， 2014， 3（1）： 44-48

18 YU Xiu-Pei， FENG Fang， TENG Bao-Qi， CHEN Yu-Yu. Pharm. Clin. Res.， 2012， 20（3）： 264-266

于秀培， 馮 芳， 滕宝褀， 陈玉宇. 药学与临床研究， 2012， 20（3）： 264-266

19 Xu J J， Li Q， Cao J， Warner E， An M R， Tan Z J， Wang S L， Peng L Q， Liu X G. J. Chromatogr. A， 2016， 1463（9）： 32-41

20 Yan H Y， Sun N， Han Y H， Yang C， Wang M Y， Wu R J. J. Chromatogr. A， 2013， 1307（17）： 21-26

21 Visser A E， Swatloski R P， Reichert W M， Griffin S T， Rogers R D. Ind. Eng. Chem. Res.， 2000， 39（10）： 3596-3604

22 Wang X Z， Li X W， Li L J， Li M， Wu Q， Liu Y， Yang J， Jin Y R. Anal. Methods， 2016， 8（35）： 6566-6572

23 Yang C， Sun Y Y， Kyung H R， Yan H Y. J. Chromatogr. A， 2014， 1361（26）： 53

24 CHEN Yi-Xin， FENG Qing-Sheng， WANG Xiao-Zhong， LI Lan-Jie， LI Xu-Wen， JIN Yong-Ri. Chinese J. Anal. Chem.， 2016， 44（7）： 1106-1111

陳一鑫， 冯清胜， 王晓中， 李兰杰， 李绪文， 金永日. 分析化学， 2016， 44（7）： 1106-1111

25 Li H J， Liu Y， Yi Y T， Miao Q， Liu S J， Zhao F， Cong W， Wang C H， Xia C H. J. Chromatogr. B， 2017， 1048： 56-63

Abstract A green， rapid and efficient method was developed for the extraction of 4 kinds of hosenkosides from the seeds of Impatiens balsamina L. The hosenkosides were extracted by ionic liquid， and then enriched by solid phase extraction. The effects of the kinds and volume of ionic liquid， pH value， ultrasonic time， solid phase extractant and eluent on the extraction fields were investigated and optimized. Under the optimum conditions， the recoveries of 4 kinds of hosenkosides were between 92.1% and 108.2%， the correlation coefficients were 0.9945-0.9975， and the detection limits were 1.8-4.5 μg/mL. The RSD values were all less than 3.9%. The experimental results showed that this method was fast， efficient， environmental protection. This study provided a reference for the extraction and enrichment of trace components in Chinese medicinal herbs.

Keywords Ionic liquid； Solid phase extraction； Seeds of Impatiens balsamina L； Hosenkosides； Ultrasonic-assisted

（Received 26 January 2018； accepted 7 March 2018）