单个纳米孔电流脉冲法探究鱼精蛋白与单链DNA的相互作用

王华杰 刘元敏 李光宇 吴志勇

摘 要 单个纳米孔电流脉冲法是一种新型、快速、简便的检测手段，有望实现单分子核酸测序和生物传感。由于通常条件下分子穿孔导致的电流脉冲时间短，电流水平低，对脉冲检测系统提出了很高的要求。本研究基于自行组建的单个纳米孔电流脉冲检测系统，以单个α-溶血素（α-HL）纳米孔为界面，探究了鱼精蛋白在调控ssDNA电流脉冲中的作用。结果表明，此系统不仅能够分别观测带正电的鱼精蛋白和带负电的ssDNA探针的电流脉冲信号，而且加入鱼精蛋白，可使ssDNA电流脉冲的幅度及停留时间均显著增加。本研究为基于分子相互作用提高电流脉冲的分辨能力提供了途径。

关键词 α-溶血素； 鱼精蛋白； 单链DNA； 相互作用

1 引 言

蛋白质可作为活化剂或抑制剂识别核酸不同碱基位点并与其结合，从而可以调节细胞功能。通常研究蛋白质-DNA复合物的方法包括电泳迁移率法[1]、核酸酶足迹法[2]、蛋白结合微阵列法[3]、表面等离子共振法[4]、染色质免疫沉淀法[5]等。此外还有单分子技术（SM），如原子力显微镜（AFM）[6]、荧光共振能量转移[7]、光镊子[8]和磁镊子[9]。当生物分子穿过单个纳米孔道时，可产生特征的电流脉冲信号，可用于单分子检测[10]。该方法具有无需标记、操作简单、成本低廉等优点，在DNA测序方面展现出良好的应用前景。该方法还可用于分析多种目标组分，如RNA[11]、多肽[12]、蛋白质[13]、聚合物[14]、纳米粒子[15]、金属离子[16，17]等，以及在单分子水平上研究生物分子相互作用以及构象变化[18]。DNA分子与其它分子通过相互作用形成复合物后，能够产生特异性的电流脉冲信号[19]。如转录因子（RepE）与带有前导寡链核苷酸的dsDNA作用形成复合物，进入α-溶血素纳米通道，产生与带有前导寡链核苷酸的dsDNA分子不同的脉冲信号，从而能够在单分子水平上测定转录因子（RepE）与dsDNA的相互作用[18]。α-溶血素是一种膜结合蛋白，通过自组装可在细胞的双层磷脂膜上形成跨膜纳米孔[20]。1996年， α-溶血素纳米孔首次被用于单个DNA分子的电流脉冲检测，是目前应用最为广泛的生物蛋白孔，其cis端直径为2.6 nm，trans端直径为2.2 nm，中间收缩区直径为1.4 nm，因尺度限制仅容许单链DNA、RNA和一些多肽的通过。

鱼精蛋白是一种分子量较小（由30～50个氨基酸组成）的多肽[21]，主要由精氨酸组成，是典型的碱性蛋白。在食品工业及生物医学方面应用广泛[22，23]。单个纳米孔道的电化学空间限域效应放大了生物分子间的弱相互作用， 可实现单个生物分子微小构型变化的超灵敏检测[24～27]。鱼精蛋白能与DNA紧密地结合从而使精子中的遗传物质高度浓缩而停止转录。本研究基于超微电流放大器，利用α-HL生物纳米孔界面对鱼精蛋白以及鱼精蛋白与ssDNA的相互作用的电流脉冲特征进行了考察。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

DFCA-001超高灵敏度电流放大器（华东理工大学研制）[28]；CHEM HS Spare Headstage，N=1（美国Dagan Corporation）；NI-USB 6216数据采集板卡（美国国家仪器有限公司）；检测池（孔径150 μm， 美国Warner Instruments公司）；PB-10型pH计，Sartorius BS-110s型电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；TGL-16GB台式高速离心机（上海菲恰爾分析仪器有限公司）。

三（羟甲基）氨基甲烷（﹥99.0%）、冻干α-溶血素（美国Sigma-Aldrich公司）； 1，2-二植烷酰基磷脂（CHCl3溶液，美国Avanti Polar Lipids公司）； 正癸烷（﹥99.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）； HCl（分析纯，沈阳化学试剂厂）； KCl（﹥99.8%，优级纯，国药集团化学试剂有限公司）； 乙二胺四乙酸（分析纯，天津大茂化学试剂厂）； 鱼精蛋白（北京索莱宝生物科技有限公司）； Poly（dC）50、Poly（dC）30、Poly（dC）20、Poly（dA）20、Poly（dT）20（上海生物工程股份有限公司）。

2.2 实验方法

2.2.1 α-溶血素双分子膜的形成 所用电流脉冲检测界面示意图如图1A所示。先用洁净的貂毛笔刷在检测池微米孔的两侧涂覆磷脂正癸烷溶液，将cis检测池和trans检测池组装后，分别加入1 mL缓冲储备液（pH=8.0，10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，1 mol/L KCl），用提拉法形成磷脂双分子层膜。通过Ag/AgCl向磷脂双分子层膜两端施加+100 mV电压（cis端接地），在cis端微孔处注入2.5 μL 1.25 μg/mL α-溶血素并在磷脂双分子层膜上自组装形成一个稳定的纳米通道。电流从0 pA阶跃到约100 pA时，表明单个α-溶血素蛋白通道自组装成功。

2.2.2 信号采集与处理 将待测分子加在cis端，产生的电流脉冲信号先经CHEM HS Headstage前置放大器转化为电压信号（增益0.1 mV/pA）后，再经DFCA-001放大器放大（带宽为5 kHz，增益10 mV/pA）。预处理的模拟信号以100 kHz的采样频率经NI-USB 6216数据板卡进行采集和记录。所得数据通过LabVIEW程序实时观测并记录，用Origin 8.5数据软件和华东理工大学开发的MATLAB软件对单个纳米孔阻塞信号进行识别和处理[29]。

3.2 鱼精蛋白与ssDNA相互作用的脉冲变化

将带负电的ssDNA加到cis端，并在trans端施加正电压，对其穿孔引起的电流脉冲进行检测。而在相同条件下，带正电的鱼精蛋白只有加在trans端才可观测到脉冲（图2A）。在+100 mV电压下，鱼精蛋白从trans端到cis端的电流脉冲信号如图2D所示，图2G为典型脉冲放大图。由此可见，鱼精蛋白也可从trans端通过界面，并产生对应的脉冲信号。Poly（dC）50带负电荷，在同样的电压偏置下，从cis端穿越到trans端产生电流脉冲信号（图2B），对应的电流脉冲及典型放大图如图2E和图2H所示。为了观测poly（dC）50与鱼精蛋白相互作用引起的电流脉冲变化，预先将鱼精蛋白分子与poly（dC）50以浓度比10∶1充分混合后，加入到cis端（图2C），在相同电压偏置条件下，观测到的电流脉冲及典型放大图（图2F和图2I）。综合以上结果可知，由于鱼精蛋白和poly（dC）50电性相反，产生脉冲信号的条件及脉冲形态均有很大不同。二者相互作用后仍观测到脉冲，表明复合的结果未改变poly（dC）50的电性。但是其脉冲的特征发生了显著性改变，脉冲幅度（△I）及停留时间（toff）均增大（图2H和图2I）。图3及表1为如上3种情况下电流脉冲信号的统计结果。由于鱼精蛋白与ssDNA的作用，ssDNA的脉冲的停留时间和脉冲深度均有显著增加，这可能与鱼精蛋白与ssDNA作用后导致的分子尺度的增大和有效电荷的减少有关。

3.3 魚精蛋白与不同链长ssDNA的相互作用

如图4和表2的统计结果显示，poly（dC）20-protamine复合物与poly（dC）20阻断时间相比，前者的阻断时间明显增加，而二者阻断电流深度相差不大。Poly（dC）30-protamine复合体与poly（dC）30的阻断时间相差不大，阻断电流深度增大，并且长阻断脉冲数明显增多。 Protamine-poly（dC）50复合体与poly（dC）50相比，阻断时间与阻断电流均增大约1倍。由此可知，鱼精蛋白与不同链长的ssDNA作用有提高不同链长同种碱基ssDNA的脉冲幅度分辨的能力，但停留时间与链长缺乏相关性。

3.4 鱼精蛋白与不同种类ssDNA相互作用

为了研究相同链长不同碱基的ssDNA与鱼精蛋白形成的复合物的穿孔行为变化，用等碱基数的poly（dA）20、poly（dT）20、poly（dC）20进行了测试。poly（dA）20与Poly（dA）20-protamine复合体相比，二者的阻断时间相差不大，但是长阻断脉冲的出现的频率明显增多（图5A），复合物的阻断电流比明显增加。

4 结 论

基于非商品化超微微电流放大器建立的电流脉冲检测系统，采用野生型α-溶血素单个纳米孔界面，探究了鱼精蛋白用于调控ssDNA电流脉冲的方法。结果表明，本系统不仅能够分别检测鱼精蛋白和ssDNA的脉冲信号，而且二者的相互作用可以明显改变ssDNA的电流脉冲信号。 ssDNA与鱼精蛋白相互作用的结果使得ssDNA的电流脉冲停留时间和阻断电流均有明显增加。因此，基于带正电的鱼精蛋白与ssDNA的相互作用可能成为调控其电流脉冲的一种有效手段。

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