离子液体电解质对DNA穿过α—溶血素纳米孔的影响

孙珊珊 刘元敏 李光宇 吴志勇

摘 要 不同堿基的DNA分子空间占位和带电状态存在差异，其通过单个纳米孔时可引起特征性的电流脉冲变化，有望成为新一代单分子测序方法。然而，常规条件下DNA分子穿过纳米孔的速度很快（102 s），引起的电流变化小（pA级），因此分子亚结构信息的准确获取对现有仪器设备的性能提出了极高要求。本研究在α-溶血素纳米孔的两端分别引入高粘度和离子导电性较好的离子液体支持电解质，以构建粘度梯度体系，并对溶液的酸度进行优化，以期对ssDNA穿孔行为进行调控。初步的研究结果表明，在trans端为纯离子液体BmimPF6，cis端为1 mol/L BmimCl、10 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 5.5）的条件下，poly（dC）15、poly（dC）20、poly（dC）30和poly（dC）50均出现高抑制比的长阻断电流脉冲信号，长阻断事件的阻断深度达95%以上，持续时间达102～101 s；同时，基线噪音峰峰值也降低约30%。对可能的机理进行了探讨。本研究结果表明，采用离子液体粘度梯度支持电解质体系可以有效调控ssDNA的迁移行为。

关键词 单个纳米孔； α-溶血素； 单链DNA； 离子液体

1 引 言

由于不同碱基的空间占位和带电状态不同，在电场力驱动下，DNA分子通过单个纳米孔时产生电流脉冲变化，依据其阻断深度和阻断时间特征有望获得分子的带电情况以及构象等信息，因而可能成为基于单分子的第三代测序技术[1]。基于单个纳米孔电流脉冲的传感和检测方法具有成本低、速度快和数据分析相对简单等优势。在常规的支持电解质条件下，DNA分子穿孔速度快（4～10 μs/base），这对单个碱基的精准检测提出了挑战[2]。

常用的调控穿孔速度的方法有增加纳米孔内壁与DNA分子间的相互作用，如纳米孔内壁修饰正电荷增强其与DNA分子间的静电作用[3，4]、在纳米孔内壁共价连接环糊精减小纳米孔孔径以增加DNA分子穿孔时的摩擦力[5，6]或是采用光镊[7]、磁镊[8]、分子马达[9]等方法增加DNA分子迁移时的机械阻力。另一类方法则是通过改变缓冲介质条件，如降低温度[10]、调节溶液酸度[11]、使用谷氨酸盐[12]等高粘度的支持电解质，以增加DNA分子迁移时的流体阻力，降低DNA分子的迁移速度。离子液体（IL）是一类在室温或接近室温下呈现液态的低温熔融盐。其咪唑盐离子Bmim+与DNA分子之间存在静电和疏水性缔合作用[13～16]，从而形成稳定的复合物。α-溶血素纳米孔的限制孔径仅略大于ssDNA分子直径[17]，而Bmim+与DNA分子形成的复合物体积变大，因而有望产生更加明显的阻断信号。2009年，de Zoysa等[18]以突变体（M113F）7 α-溶血素（α-HL）蛋白通道为传感器，在120 mV偏置电压和1 mol/L氯化1-丁基-3-甲基咪唑（BmimCl）均匀电解质条件下观测到ssDNA产生长短两种阻断信号，长阻断信号的停留时间比常用的KCl电解质增加了近两个数量级。2015年，Feng等[19]以1-甲基-3-丁基六氟磷酸盐（BmimPF6）和KCl为支持电解质，在二硫化钼单个固态纳米孔两端构建了粘度梯度体系，基于Bmim+与DNA分子之间及DNA分子与孔内壁之间的相互作用，实现了不同碱基的单核苷酸的识别。

4 结 论

基于集成电流脉冲检测系统（eONE）和α-HL蛋白孔研究了含有离子液的支持电解质、粘度梯度以及酸度对ssDNA迁移行为的影响。咪唑类离子液体中Bmim+与DNA分子中磷酸基团上的氧负离子发生键合作用，使得ssDNA的有效体积变大，其在纳米通道内的阻断深度和迁移时间明显增加。同时，在α-HL纳米孔的trans端引入高粘度的BmimPF6离子液体，建立粘度梯度，增大了DNA分子穿孔时的能垒。初步研究结果表明，在优化的粘度梯度体系和优化酸度条件下，体系表现出对不同链长DNA的停留时间和不同碱基捕获率的区分能力。对于长链DNA（poly（dC）50），其阻断时间相比于常规介质条件增加了3个数量级。采用离子液体粘度梯度支持电解质体系可以有效地调控ssDNA的迁移行为。

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Abstract Due to the difference in spatial configuration and charge of the bases in a DNA molecule， characteristic translocation current pulses through a single nanopore could be obtained. This could become the basis of DNA sequencing method. However， due to the fast translocation speed （sub-micro seconds） and the small current change （about pA）， it is still a challenge to obtain the accurate molecular substructure with present electronic techniques. In this work， in order to control the translocation behavior of ssDNA， two kinds of ionic liquids with high viscosity and conductivity were introduced to establish a viscosity gradient with the α-hemolysin single nanopore interface and the acidity of the solution was optimized. The trans chamber contained pure BmimPF6 and the cis chamber contained 1 mol/L BmimCl and 10 mmol/L Tris-HCl （pH 5.5）. Preliminary experiment results under this electrolyte configuration showed that poly（dC）15， poly（dC）15， poly（dC）30 and poly（dC）50 exhibited obvious long duration pulses with high current suppression ratio. The blocking depth reached more than 95% of long blocking events. The duration time of long blocking events prolonged to tens or hundreds of milliseconds. Meanwhile， the peak-peak of baseline noise was reduced by about 30%.

Keywords Single nanopore； α-Hemolysin； Single-stranded DNA； Ionic liquid

（Received 17 November 2017； accepted 25 April 2018）