高效液相色谱分析法同时检测食品中的5种添加剂

◎ 黎 东

（南充市食品药品检验所，江西 南充 637000）

随着人们生活水平的提高，各种外形新奇、口味鲜美的食品成为市场主角。食品添加剂在食品生产加工中具有重要作用。GB 2760-2014中规定了2 000种以上的食品添加剂限量要求。山梨酸、苯甲酸、脱氢乙酸作为广谱防腐剂，能抑制多种霉菌细菌生长繁殖。安赛蜜及糖精钠是人工合成甜味剂，是糕点中常用的食品添加剂。一些厂商为改善口味，延长保质期，常违规使用这些防腐剂与甜味剂，其对人体健康有不同程度的危害。为保证食品质量安全，建立快速高效的检测方法具有重要意义。

本文研究了液相色谱法测定食品中的5种添加剂的方法，探索了色谱条件对检测结果的影响，建立了相应的检测方法。研究结果：采用液相色谱法能同时定性定量分析食品中的山梨酸、苯甲酸、脱氢乙酸、糖精钠、安赛蜜。测定条件：色谱柱ZORBAX SB-C18柱分离，甲醇∶0.02 mol/L乙酸铵溶液=5∶95为流动相，流速1.0 mL/min，紫外检测波长为230 nm。5种添加剂为400 μg/mL时相关性良好。最小检出限介于0.196～1.452 mg/kg。相对标准偏差＜5%，回收率＞90%，该方法检测快捷高效，便于检测人员对食品中5种添加剂含量情况作出快速判断。

1 食品添加剂简述

食品添加剂是为改善食品品质，为防腐与加工工艺需要加入的人工或天然物质。目前，我国食品添加剂有2 000多种。

防腐剂在食品加工中主要用于防止食品腐败变质，防腐剂超量使用会对人体产生毒副作用。考虑到食品安全，食品防腐剂的定性定量检测非常重要。国内目前对食品防腐剂检测为针对某一类食品的一种防腐剂进行检测，而对超范围添加的非法添加物不能有效检测。目前，我国粮食损失约占10%，肉类食品损失在30%左右。食品带菌严重，致使疾病蔓延。传统食品保藏技术能够延长食品保质期，但破坏了食品营养成分。随着能源的大量使用，产生了环境污染问题。防腐剂能有效延缓食品变质，保护食品资源不受损失，保证食品在市面流通时不因微生物污染而危害人体健康。食品防腐剂能防止由微生物引起的腐败变质，兼有防止微生物繁殖引起食物中毒的作用。卫生部颁布的《食品添加剂使用卫生标准》严格规定了食品添加剂的添加范围，为食品生产企业提供了食品生产技术规范，为保证食品添加剂的安全使用发挥了重要作用。严格遵循标准使用添加剂，会减轻微生物污染与营养不均衡的危害[1]。

人们对健康的要求越来越高，希望食品中的甜味剂尽可能低甚至为零。甜味剂指赋予食品或饲料以甜味，满足人们对食品要求的食物添加剂。合格的甜味剂对人体没有影响，但是长期摄入甜味剂会对人体产生危害。甜味剂应具备安全性高、稳定性好、价格合理等特点。

食品样品前处理是食品检测的关键环节。高效快速的样品制备与检测技术研究成为现代分析化学的热点之一。目前，食品添加剂检测方法主要是色谱法，因为色谱方法成本低，易操作。

2 高效液相色谱法

液相色谱法最早出现于1903年，20世纪60年代，气相色谱理论技术应用到液相色谱中。高效液相色谱法可以分析用气相色谱难以分析的物质，其应用范围远超气相色谱。液相色谱检测器具有多样性，其基本原理为溶质物理化学性质与流动相有差异，在色谱图上以色谱峰的形式记录，当溶质从色谱柱流出时，会导致流动相背景值发生变化。

高效液相色谱法采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂等流动相泵入色谱柱，由流动相带入柱内，各成分被分离后进入检测器检测。仅根据保留时间对未知样品定性较为困难，仅靠色谱本身不能对未知的化合物进行定性，相应信号缺乏典型的分子结构特征，只能鉴定已知的化合物。

定量分析目的是求出样品中被分析物的含量，组分在流动相中浓度与检测器相应信号成正比。样品中杂质定量检测方法，验证需测定其准确性、精密性、线性等5个指标[2]。

3 检测实验

3.1 实验材料与实验方法

3.1.1 实验材料

①实验原料为市售饮料、调味品等。②实验仪器包括安捷伦1260高效液相色谱仪，自动进样器，PURELAB flex超纯水机，高速冷冻离心机，超声波清洗仪。③主要试剂包括甲醇、乙酸铵、乙酸锌、亚铁氰化钾。标准样品为苯甲酸、糖精钠、山梨酸、脱氢乙酸（生产厂家德国Dr.Ehrenstorfer GmbH，纯度=99.9%），安赛蜜（生产厂家德国Dr.Ehrenstorfer GmbH，纯度=99%）。相关参数见表1。

表1 5种添加剂的相关计算数据表

3.1.2 标准溶液配制

①脱氢乙酸标准溶液。称取脱氢乙酸标准品0.101 0 g，以NaOH溶液（20 g/L）溶解，得到浓度为1.0 mg/mL的脱氢乙酸标准溶液。②混合标准溶液。将含苯甲酸、山梨酸、安赛蜜、糖精钠等添加剂的溶液稀释配制成待用混合标准溶液。③亚铁氰化钾溶液。在烧杯中取106 g亚铁氰化钾，转移至1 000 mL容量瓶中，定容备用。④乙酸锌溶液。在烧杯中称取220 g乙酸锌，转移至1 000 mL容量瓶中，定容备用，0.02 mol/L。⑤乙酸铵溶液。称取1.54 g乙酸铵，转移至1 000 mL溶液瓶中，经抽滤超声波脱气后备用。相关参数见表2。

表2 不同食品中5种添加剂参数表

3.1.3 色谱条件

色谱柱，ZORBAX SB-C18柱，检测器扫描提取230 nm波长。柱温30 ℃，甲醇-0.02 mol/L乙酸铵溶液。进样量10 μL，流速1.0 mL/min。

3.1.4 样品前处理

称取5 g（精确至0.001 g）样品至小烧杯中，转移到50 mL的容量瓶中。3次清洗烧杯后将样品置入容量瓶中。先后加入乙酸锌及亚铁氰化钾3 mL，超声波提取15 min，4 000 r/min离心5 min，吸取上清液滤膜至进样瓶中待检。

3.1.5 定性定量方法

将配制好的5种添加剂混合标准溶液稀释至不同浓度。经液相色谱分析，由出峰时间定性，峰面积为纵坐标，标准品浓度作为横坐标制作标准曲线，计算目标样品物含量为5 g[3]。

3.2 实验结果

3.2.1 色谱柱的选择

试验考察了ZORBA× SB-C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）液相色谱柱，ZORBA× SB-C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）液相色谱柱色谱柱长分析时间长，色谱柱过短，导致5种添加剂分离不完全。最终选择ZORBA×SB-C18柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）进行实验。

3.2.2 检测波长的选择

安捷伦1260高效液相色谱仪DAD二极管阵列检测器可全波长扫描目标化合物。将波长设置在190～400 nm，最终确定5种食品添加剂检测波长为230 nm。

3.2.3 流动相的优化

甲醇-0.02 mol/L乙酸铵溶液为流动相，（甲醇 ∶ 乙 酸 铵 溶 液 =80∶ 20、85∶ 15、90∶ 10、5∶95），最终确定甲醇乙酸铵溶液为5∶95时5种添加剂分离效果最好。

3.2.4 标准曲线与线性范围

绘制标准曲线，以检测结果的3倍信噪比计算检出限80%。该方法比中国国家液相色谱法标准有更高的灵敏度。

3.2.5 加标回收实验精密度

选取糕点、饮料为检测对象，作加标回收实验。采用该方法检测以上基质均有良好的回收率，相对标准偏差（n=6）值均小于7%。该方法具有较高的精密度及较广泛的适用范围。

3.2.6 基质适用性分析

选用市售饮料等具有代表性的食品样品进行防腐剂和甜味剂检测，可同时检测多种类型样品中的防腐剂和甜味剂。

3.3 实验讨论

提取需确定所有目标分析物在分层提取中的分配系数，确保目标分析物在液液萃取时有较高回收率。将防腐剂、甜味剂标准品混合溶液加入互不溶的溶剂中，用液相色谱检测不互溶防腐剂含量，检测各萃取溶剂中目标分析物浓度比，估算防腐剂和甜味剂溶剂分配。利用亚铁氰化钾和乙酸锌溶液除去食品基质中的蛋白质杂质，发现对防腐剂和甜味剂的回收率影响不大。

4 结论

本实验建立了同时检测多类型食品中苯甲酸、安赛蜜、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸的方法。采用ZORBAX SB-C18柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）分析，流动相为甲醇∶乙酸铵溶液（0.02 moL/L）=5∶95，流速为1.0 mL/min，230 nm波长下检测，该方法检测食品类别涵盖范围较广，具有经济高效安全等特点，能同时检测不同食品中的防腐剂和甜味剂。