抗白羽肉鸡传染性法氏囊病中草药复方制剂的开发及应用

黄亚东，黄 妍，窦如颖，薄洪峰

（1.江苏食品药品职业技术学院，江苏 淮安 223003；2.淮阴区动物卫生监督所，江苏 淮安 223001）

鸡传染性法氏囊病 （infectious bursal disease，IBD）又称鸡传染性腔上囊病，是由传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus，IBDV）引起的一种急性、接触性、免疫抑制性传染病，以法氏囊发炎、坏死、萎缩及法氏囊内淋巴细胞严重受损为特征，易引起免疫机能障碍，干扰各种疫苗的免疫效果，该病的发病率、死亡率较高［1］。当前，部分肉鸡养殖企业及养殖户为追求片面经济效益而滥用抗菌药物和激素的现象比较严重，不仅造成鸡体内药物残留和蓄积，产生毒副作用，而且还会引起鸡机体免疫力下降、病原菌耐药性增强、鸡肉品质降低和环境污染等问题，甚至严重威胁人类健康［2］。根据鸡传染性法氏囊病的发病机理及中兽医学理论，已有学者筛选出多味天然中草药用于防治该病，这些药物能促进鸡免疫器官发育，提高细胞免疫、体液免疫水平，刺激细胞因子产生，促进肉鸡生长发育，且不存在药物残留，不易产生抗药性［3］。其作用机理是通过作用于下丘脑、垂体、肾上腺皮质轴、环核苷酸系、植物神经，提高T细胞数量，从而调节免疫功能［4］。该研究旨在通过评价不同中草药复方制剂对白羽肉鸡传染性法氏囊病的预防和治疗效果，以期为开发绿色、低毒、无残留的鸡传染性法氏囊病防治药物，有效降低由该病造成的经济损失提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1实验动物：体重为18～22 g的小白鼠100只，由扬州大学动物科学学院提供；健康白羽肉鸡5 600只，由江苏省淮安市淮阴区龙云养鸡专业合作社提供。

1.1.2药品及试剂：中草药，购自淮安市淮阴区绿之康中药材种植专业合作社，符合《中华人民共和国药典》2000年版的中药材标准；鸡传染性法氏囊血凝抑制试验抗原及阳性血清，购自哈尔滨动物生物制品国家工程研究中心有限公司；鸡传染性法氏囊病病毒ELISA检测试剂盒，购自南京金益伯生物股份有限公司；复合多维，购自河北远征动物保健品有限公司。

1.1.3肉鸡饲料：淮安市宏宇科技有限公司生产。

1.1.4主要器材：台式低速离心机（型号为TD6M），购自盐城凯特实验仪器设备有限公司；透反射偏光显微镜（型号为XPF-300），购自上海蔡康光学仪器有限公司；气旋式气流粉碎分级机 （型号为LHA-40）、混合机（型号为 LHH-200），购自潍坊正远粉体工程设备有限公司；PCR组织匀浆器（型号为04750-55），购自北京中科科尔仪器有限公司；注塑式饮水器（型号为YJ-F047），购自江苏羽佳塑业有限公司；超声波中药专用雾化器（型号为KCW-6T），购自南通杰西电器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1中草药筛选试验

1.2.1.1中草药复方制剂配方：通过单味中草药筛选，初步形成防治鸡传染性法氏囊病的6个中草药处方。配方Ⅰ：由藿香、佩兰、黄芪各11%，陈皮、生甘草、白茯苓、生白术各8%，厚朴、制半夏、白芷、苏叶、防风各7%组成。配方Ⅱ：由葛根18%，黄芩10%，黄连、蒲公英、马齿苋、白头翁、连翘各13%，生甘草7%组成。配方Ⅲ：由金银花、蒲公英各22%，紫花地丁、野菊花各14%，连翘、桔梗、生甘草、苍术各7%组成。配方Ⅳ：由白芍药21%，黄芩、槟榔、当归各11%，大黄6%，肉桂、生甘草、木香各4%，无花果、蒲公英、生白术、黄连各7%组成。配方Ⅴ：由黄连、山栀各12%，蒲公英、马齿苋、木香、金银花各13%，黄芩、黄柏、生甘草各8%组成。配方Ⅵ：由白头翁16%，黄柏、秦皮、车前草各10%，马齿苋、玄参、无花果各11%，生甘草、陈皮、黄连各7%组成。配方Ⅰ～Ⅲ用于预防试验，配方Ⅳ～Ⅵ用于治疗试验。

1.2.1.2药理学试验：通过小白鼠饲喂试验、Ea花环形成率测定、EAC花环形成率测定、淋巴细胞转化率测定、中性粒细胞功能测定、红细胞免疫功能测定等药理学试验，确认中草药复方制剂对肉鸡免疫功能具有促进作用［5-6］。

1.2.1.3毒理学试验：通过小鼠急性毒性试验、微核试验、精子畸形试验，确认中草药复方制剂对小鼠无毒副作用、致变作用、生殖毒性［7］。

1.2.2预防试验：选取2 800羽白羽肉鸡，饲养全程采用相同的肉鸡饲料，且不添加任何抗生素。利用3种预防中草药复方制剂（配方Ⅰ～Ⅲ），采用拌料给药、饮水给药、雾化给药及综合预防4种方法开展预防试验，每种试验方法均设3个试验组和2个对照组。免疫程序如下：4～5日龄时，肌肉注射肾型鸡传染性支气管炎油乳剂灭活苗0.25 mL；7～9日龄时，采用鸡新城疫Ⅳ系苗+传染性支气管炎H120二联苗点眼、滴鼻各1次；14～16日龄时，采用鸡传染性法氏囊中毒苗一倍量饮水或冻干弱毒苗双倍量饮水；20～22日龄时，皮下注射禽流感疫苗；26～28日龄时，采用鸡传染性法氏囊中毒苗双倍量饮水；31～33日龄时，采用鸡新城疫Ⅳ系苗双倍量饮水。在免疫前后，使用复合多维饮水以减少应激反应。4种方法中的试验组鸡群均按照上述免疫程序免疫，但不进行鸡传染性法氏囊疫苗免疫；每种试验方法中的对照1组按照上述免疫程序免疫，对照2组不采取任何免疫措施。4种试验方法中，鸡群均自由采食和饮水，饲喂时间均为42 d。

1.2.2.1拌料给药预防试验：3种预防方剂粉碎后过筛，试验1组饲喂方剂Ⅰ，试验2组饲喂方剂Ⅱ，试验3组饲喂方剂Ⅲ，添加量均为1%。

1.2.2.2饮水给药预防试验：将预防方剂粉碎后按1 kg药材加10 L水的比例，浸泡3 h，煮沸后继续用文火熬煮1 h，压榨后取汤汁。试验1组饲喂方剂Ⅰ，试验2组饲喂方剂Ⅱ，试验3组饲喂方剂Ⅲ，每日8：00禁水2 h后饮水给药1次。

1.2.2.3雾化给药预防试验：将预防方剂粉碎后按1 kg药材加10 L水的比例，浸泡3 h，煮沸后继续用文火熬煮1 h，压榨后取汤汁，放入雾化器中。试验1组采用方剂Ⅰ，试验2组采用方剂Ⅱ，试验3组采用方剂Ⅲ，每日8：00雾化1次，雾化时间30 min。

1.2.2.4综合预防试验：试验1组利用方剂Ⅰ，试验2组利用方剂Ⅱ，试验3组利用方剂Ⅲ。每日按1%剂量拌料饲喂；8：00雾化1次，雾化时间30min；同时禁水2 h后饮水给药1次。

1.2.2.5预防效果评价指标：饲喂试验期间，观察并记录4种预防试验方法中各试验组和对照组肉鸡的发病和死亡情况，计算各组发病率和死亡率。饲喂试验结束后，采用统计学方法比较同一种方法中各组肉鸡的发病率和死亡率之间的差异。

1.2.3治疗试验：将IBDV按1∶4的比例制成悬浊液，对2 800只白羽肉鸡滴鼻、点眼，每只鸡0.05 mL，攻毒24～36 h后，当鸡群出现精神委顿、食欲下降等症状时，进行分组试验。利用3种治疗中草药复方制剂（配方Ⅳ～Ⅵ），采用拌料给药、饮水给药、雾化给药及综合治疗4种方法开展治疗试验，每种试验方法均设3个试验组和2个对照组。4种方法中的试验组鸡群按照上述4种方法进行治疗；对于每种方法中的2个对照组，对照1组使用抗生素+抗病毒药物饮水的方法进行对症治疗，持续给药至病鸡全部康复，对照2组不采取任何治疗措施。4种试验方法中，鸡群均自由采食和饮水，饲喂时间均为42 d。

1.2.3.1拌料给药治疗试验：3种治疗方剂粉碎后过筛，试验1组饲喂方剂Ⅳ，试验2组饲喂方剂Ⅴ，试验3组饲喂方剂Ⅵ，添加量均为1%。

1.2.3.2饮水给药治疗试验：将治疗方剂粉碎后按1 kg药材加10 L水的比例，浸泡3 h，煮沸后继续用小火熬煮1 h，压榨后取汤汁。试验1组采用方剂Ⅳ，试验2组采用方剂Ⅴ，试验3组采用方剂Ⅵ，每日分别于8：00和20：00禁水1 h后饮水给药1次，持续给药7 d。

1.2.3.3雾化给药治疗试验：将治疗方剂粉碎后按1 kg药材加10 L水的比例，浸泡3 h，煮沸后小火熬煮1 h，压榨后取汤汁，放入雾化器中。试验1组采用方剂Ⅳ，试验2组采用方剂Ⅴ，试验3组采用方剂Ⅵ，每日分别于8：00和20：00各雾化1次。

1.2.3.4综合治疗试验：试验1组采用方剂Ⅳ，试验2组采用方剂Ⅴ，试验3组采用方剂Ⅵ。每日按1%剂量拌料饲喂给药；将方剂制成汤剂进行饮水给药；每日8：00和20：00雾化给药各1次。

1.2.3.5治疗效果评价指标：饲喂试验期间，观察并记录4种治疗试验方法中各试验组和对照组肉鸡的治愈和死亡情况，计算各组治愈率和死亡率。饲喂试验结束后，采用统计学方法比较同一种方法中各组肉鸡的治愈率和死亡率之间的差异。

1.2.4鸡传染性法氏囊病诊断方法

1.2.4.1临床症状：精神不振，食欲废绝，畏寒发抖，扎堆，闭目嗜睡，垂翅。排白色水样粪便，泄殖腔周围羽毛被粪便污染，下痢失水，伴有呼吸道症状。发病后1～2 d病鸡增多并发生死亡，4～5 d达死亡高峰。

1.2.4.2病理解剖特征：脱水，皮下肌肉干涩，两侧股部小腿部肌肉色泽灰暗，胸肌、腿肌有块状出血，严重者整个腿肌呈红布样出血。腺胃和肌胃交界处有出血带或出血斑点，肝肾肿大，实质脆弱，脂肪变质，颜色较淡，有尿酸盐沉积使肾呈现花斑状。法氏囊充血、水肿，体积增大2～3倍，外表被覆黄色胶冻样液体，切开后黏膜皱褶浑浊不清，表面有点状出血或弥漫性出血［5］。

1.2.4.3血清学诊断：取病死鸡肿胀和有出血点的法氏囊组织，按1∶5的比例加入pH值为7.2的PBS溶液，用组织匀浆器制备混悬液，反复冻融，4 000 r/min离心10 min，以上清液待检抗原与标准阳性IBDV血清做琼脂扩散试验。若法氏囊组织与IBDV阳性血清出现清楚的沉淀线，则判定为阳性。

1.2.4.4鸡传染性法氏囊病病毒ELISA试剂盒检测：将棉签插入泄殖腔中刮取内容物，置于保存液中，用ELISA检测试剂盒进行检测，若为阳性则确诊为IBD。

表1 拌料给药预防效果 %

表2 饮水给药预防效果 %

表3 雾化给药预防效果 %

1.2.4.5PCR 诊断［8］：人工接种 IBDV，间隔不同时间采集鸡法氏囊、胸腺、脾、盲肠、扁桃体、肾、肝和腿肌组织样本进行RT-PCR检测，同时观察各组织的病理变化。接种4 h后，肝、肾、脾等组织即出现明显的阳性信号，即诊断为IBDV感染。或选取IBDV的高度保守序列进行PCR检测，取病死鸡的法氏囊，剪碎，研磨，提取病毒RNA，反转录合成cDNA。利用国际动物卫生组织（OIE）已发表的相关引物 （上游引物序列：5′-TGTAAAACGACGGCCAGTGCATGCGGTATGTGAGGCTTGGTGAC-3′，下游引物序列：5′-CAGGAAACAGCTATGACCGAATTCGATCCTGTTGCCACTCTTTC-3′） 进 行PCR扩增反应，目的片段大小为604 bp。

2 结果与分析

2.1 预防效果

2.1.1拌料给药预防效果：由表1可知，在拌料给药预防试验中，试验2组肉鸡的发病率显著低于试验1组、试验 3组和对照1组（P＜0.05），试验1组和试验3组肉鸡的发病率与对照1组相比差异不显著（P＞0.05），对照2组肉鸡的发病率极显著高于其他4组（P＜0.01）；试验2组肉鸡的死亡率显著低于试验1组、试验3组（P＜0.05），试验1组和试验3组肉鸡的死亡率显著高于对照1组 （P＜0.05），对照2组肉鸡的死亡率极显著高于其他4组（P＜0.01）。

表4 综合预防试验效果 %

2.1.2饮水给药预防效果：由表2可知，在饮水给药预防试验中，3个试验组肉鸡的发病率与对照1组相比差异不显著（P＞0.05），对照2组肉鸡的发病率极显著高于其他4组（P＜0.01）；试验1组和试验3组肉鸡的死亡率显著低于对照1组 （P＜0.05），试验2组肉鸡的死亡率极显著低于试验1组、试验3组和对照1组（P＜0.01），对照 2组肉鸡的死亡率极显著高于其他4组（P＜0.01）。

2.1.3雾化给药预防效果：由表3可知，在雾化给药预防试验中，3个试验组肉鸡的发病率与对照1组相比差异不显著（P＞0.05），对照2组肉鸡的发病率极显著高于其他4组（P＜0.01）；试验1组肉鸡的死亡率显著低于对照1组 （P＜0.05），试验2组和试验3组肉鸡的死亡率极显著高于试验1组和对照1组（P＜0.01），对照2组肉鸡的死亡率极显著高于其他 4 组（P＜0.01）。

2.1.4综合预防试验效果：由表4可知，在综合预防试验中，3个试验组肉鸡的发病率与对照1组相比差异不显著（P＞0.05），对照2组肉鸡的发病率极显著高于其他4组（P＜0.01）；试验2组肉鸡的死亡率极显著低于试验1组、试验3组和对照1组（P＜0.01），试验1组肉鸡的死亡率极显著高于试验3组和对照1组（P＜0.01），试验3组肉鸡的死亡率与对照1组相比差异不显著（P＞0.05），对照2组肉鸡的死亡率极显著高于其他4组（P＜0.01）。

2.2 治疗效果

2.2.1拌料给药治疗效果：由表5可知，在拌料给药治疗试验中，3个试验组肉鸡的治愈率与对照2组相比差异不显著（P＞0.05），对照组1肉鸡的治愈率极显著高于其他4组（P＜0.01）。

表5 拌料给药治疗效果 %

表6 饮水给药治疗效果 %

表7 雾化给药治疗效果 %

表8 综合治疗试验效果 %

2.2.2饮水给药治疗效果：由表6可知，在饮水给药治疗试验中，3个试验组肉鸡的治愈率极显著高于对照2组（P＜0.01），试验1组和试验 2组肉鸡的治愈率与对照1组相比差异不显著 （P＞0.05），试验1组和试验2组肉鸡的治愈率极显著高于试验3组（P＜0.01），试验3组肉鸡的治愈率极显著低于对照 1组（P＜0.01）。

2.2.3雾化给药治疗效果：由表7可知，在雾化给药治疗试验中，3个试验组肉鸡的治愈率极显著低于对照1组（P＜0.01），试验1组和试验2组肉鸡的治愈率极显著高于对照2组（P＜0.01），试验3组肉鸡的治愈率与对照2组差异不显著（P＞0.05）。

2.2.4综合治疗效果：由表8可知，在综合治疗试验中，3个试验组肉鸡的治愈率极显著高于对照2组（P＜0.01）；试验1组和试验2组肉鸡的治愈率与对照1组差异不显著（P＞0.05），但显著高于试验3组（P＜0.05）；试验3组肉鸡的治愈率显著低于对照 1 组（P＜0.05）。

3 讨论与结论

在预防试验中，试验组肉鸡均出现IBDV感染情况，但配方Ⅱ的综合预防效果优于其他2个配方。虽然对照组鸡群进行了IBD免疫，但仍可检出阳性病例，分析原因有2种可能：一是法氏囊疫苗保护率低，二是病鸡感染其他病原后机体抵抗力减弱，被法氏囊病毒再次感染。

在治疗试验中，配方Ⅴ的综合治疗效果最佳，可代替或部分代替抗生素及抗病毒药物，为最佳治疗配方。饮水给药治疗和综合治疗方法的效果明显优于拌料给药治疗和雾化给药治疗方法，后两者的治疗效果不佳可能与肉鸡发病后采食量下降、呼吸不畅，不能摄入足够的药量有关。

该研究结果表明，天然中草药复方制剂具有一定的预防和治疗肉鸡传染性法氏囊病的功效。