西藏乡土乳酸菌和商品乳酸菌制剂对箭筈豌豆青贮发酵品质的改善效果

周佳佳 ，原现军 ，陈 雷 ，董志浩 ，王思然 ，邵 涛

（1.贵州黔西南喀斯特区域发展研究院，贵州 兴义 562400；2.南京农业大学饲草调制加工与贮藏研究所，江苏 南京210095）

西藏是我国传统的五大牧区之一，其中奶牛养殖业是当地畜牧业的支柱产业，对西藏经济和社会发展起着重要作用。然而，高海拔、高寒、高辐射以及气候垂直变化大等特点共同构成了西藏复杂的气候条件、特殊的生态环境［1］，造成秋冬季节饲草料短缺，严重影响了奶牛健康生长和生产力的发挥，导致产奶量、乳品质和繁殖率低下。为了解决天然草场枯竭导致的饲草短缺的问题，将夏季富余的牧草调制成优质青贮饲料可以满足奶牛全年对饲草料的需求［2］，因此，如何提高青贮饲料发酵品质成为西藏地区奶牛养殖业发展的关键环节和重要措施。

乳酸菌制剂是目前青贮饲料调制中常用的添加剂。同型乳酸发酵可以促进青贮初期乳酸快速发酵，迅速降低pH值，抑制青贮过程中有害微生物的生长繁殖，提高青贮发酵品质［3-4］。王奇等［5］报道商品乳酸菌制剂难以适应西藏高海拔、高辐射、低温的极端气候条件，限制了其性能的发挥。杨晓丹［6］筛选和分离西藏牧草和农作物秸秆青贮饲料中耐低温的乳酸菌，进行苇状羊茅青贮试验，结果表明，与商品乳酸菌相比，耐低温的乳酸菌能有效提高青藏高原苇状羊茅青贮发酵品质。因此，发掘和利用青藏高原特有的乡土乳酸菌种质资源，发挥其适应性强的特性，对于该地区优质青贮饲料的生产，促进畜牧业的发展具有重要意义。

该试验将南京农业大学饲草调制加工与贮藏研究所从西藏豆科牧草和农作物秸秆青贮饲料中分离、筛选出的优良耐低温乳酸菌菌株添加到箭筈豌豆中进行青贮验证试验，评价乳酸菌菌株对箭筈豌豆青贮发酵品质的影响，为西藏地区优质青贮饲料的专用乳酸菌添加剂的研制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

pH计、分光光度计、高效液相色谱仪、全自动凯氏定氮仪、恒温水浴锅、摇床、灭菌锅、烘箱、培养箱等。

1.2 试验材料

箭筈豌豆种植于西藏日喀则地区草原工作站试验地。该地区属于高原亚寒带半干旱季风气候，平均海拔 3 836 m，北纬 29°16′，东经 88°51′，年均降雨量为422.4 mm，平均气温6.3℃，年平均日照时数3 233 h。将处于结荚期的箭筈豌豆于2015年9月28日刈割。青贮材料化学成分及微生物数量见表1。

1.3 试验菌种

采用传统培养及分子生物学手段分离该试验所需的乡土乳酸菌，并通过革兰氏染色、镜检、过氧化氢酶、不同温度生长试验，糖发酵试验和16S rRNA序列同源性分析进行鉴定，最终从西藏豆科牧草和农作物秸秆青贮饲料中筛选出3种乡土乳酸菌，分别为HG24、LMG4、LOG5。将已经活化2次的各种乡土乳酸菌菌液接入MRS液体培养基，于30℃培养24 h后，在箭筈豌豆刈割当天以3 000 r/min离心5 min，用生理盐水调为107CFU/mL。

商品乳酸菌制剂 （L.plantarum MTD-1购自英国弗兰克国际有限公司），为同型乳酸菌，按说明书称取适量，并用生理盐水将浓度调为107CFU/mL。

1.4 试验方法

1.4.1试验设计：试验采用单因子设计，设对照组（C，无添加）、商品乳酸菌制剂添加组（G）、乡土乳酸菌添加组 （分别添加西藏乡土乳酸菌HG24、LMG4、LOG5），共5个试验组。将箭筈豌豆切短后，对照组加入等量的蒸馏水，其余各组均分别添加1 mL菌液，充分混合均匀后，装入1 L的实验室青贮窖（聚乙烯瓶）中，各处理组3个重复，密封后，分别置于室温条件下保存，60 d后开封，取样分析。

1.4.2样品处理：在青贮第60天打开实验室青贮窖取出全部青贮饲料，将其混合均匀称取35 g放入100 mL的广口三角瓶，加入70 mL去离子水，4℃浸提24 h，然后使用2层纱布和定性滤纸过滤，所得液体为青贮饲料浸提液，置于－20℃冷冻冰箱保存待测，并将剩余部分青贮饲料收集烘干。其中，滤液用来测定pH值、乳酸（lactic acid，LA）、氨态氮（ammonia nitrogen，AN）和挥发性脂肪酸（volatile fatty acid，VFAs）的含量；烘干的青贮饲料用来测定干物质（dry matter，DM）、中性洗涤纤维 （neutral detergent fiber，NDF）、 酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）、 总氮 （total nitrogen，TN）以及水溶性碳水化合物（water soluble carbohydrate，WSC）含量。

表2 西藏乡土乳酸菌和商品乳酸菌制剂对箭筈豌豆青贮饲料发酵品质的影响

1.4.3测定项目及方法：原料草和青贮饲料在65℃烘箱中干燥60 h至恒定重量，测定DM含量［7］；盐酸—氢氧化钠滴定法测定缓冲能；精密pH计测定pH值；蒽酮—硫酸比色法测定WSC［8］；苯酚—次氯酸钠比色法测定AN；范式法应用滤袋技术测定NDF和ADF［9］，其中NDF需加入耐高温α淀粉酶；全自动凯氏定氮仪测定TN［7］；对羟基联苯比色法测定LA含量；高效气相色谱仪测定VFAs（包括乙酸、丙酸和丁酸），色谱柱为30 m×0.25 mm×0.25 μm毛细管柱，柱温140℃，汽化室温度180℃，氢气检测器220℃；平板计数法测定乳酸菌、好氧菌和酵母菌数量，选用的培养基有MRS琼脂培养基、营养琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行培养，其中，乳酸菌用厌氧培养箱，30℃培养3 d，好氧性菌和酵母菌用生化培养箱，30 ℃培养 3 d［10］。

1.4.4费氏评分：费氏评分体系［11］以青贮饲料发酵周期结束时的pH值和干物质含量（DM）为评价指标，根据方程进行青贮发酵质量评价，满分为100分，其方程为：

依据评分结果对青贮饲料品质进行评级：优（＞80）、良（60～80）、一般（40～60）、差（20～40）、劣质（＜20）。

1.4.5数据处理与统计：用Excel对数据进行整理，采用SAS 9.2软件对试验数据进行单因子方差分析（One-way ANOVA），Duncan氏法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 西藏乡土乳酸菌和商品乳酸菌制剂对箭筈豌豆青贮饲料发酵品质的影响

如表2所示，青贮60 d后，与对照组相比，各添加组 pH值显著低于对照组 （P＜0.05）；HG24、LMG4、LOG5组乳酸含量显著高于对照组 （P＜0.05），而 G组与对照组无显著差异 （P＞0.05）；HG24、LMG4、LOG5组的乙酸含量显著低于对照组（P＜0.05），G 组显著高于对照组（P＜0.05）；各添加组丙酸含量显著低于对照组（P＜0.05）；HG24组和LMG4组丁酸含量显著低于对照组 （P＜0.05），LOG5、G 组与对照组无显著差异（P＞0.05）；HG24、LMG4、LOG5组乳酸/乙酸比显著高于对照组 （P＜0.05），G 组与对照组无显著差异（P＞0.05）；各添加组的氨态氮/总氮值显著低于对照组 （P＜0.05）；各组总挥发性脂肪酸含量与乙酸的变化基本一致。

此外，在各添加组中，与G组相比，HG24、LMG4、LOG5 组的 pH 值、氨态氮/总氮值、乙酸、总挥发性脂肪酸含量均显著低于G组 （P＜0.05）；乳酸含量、乳酸/乙酸比显著高于 G 组（P＜0.05）；丁酸含量无显著差异（P＞0.05）。

2.2 西藏乡土乳酸菌和商品乳酸菌制剂对箭筈豌豆青贮饲料营养价值的影响

由表3可知，各组干物质、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量无显著差异（P＞0.05）；各添加组水溶性碳水化合物含量显著高于对照组 （P＜0.05），但各添加组之间无显著差异（P＞0.05）。

2.3 西藏乡土乳酸菌和商品乳酸菌制剂对箭筈豌豆青贮饲料微生物数量的影响

由表4可知，各组酵母菌数量无显著差异（P＞0.05）；各添加组的乳酸菌数量显著高于对照组（P＜0.05）；HG24、LMG4、LOG5 组的好氧菌数量均显著高于对照组（P＜0.05）；HG24、LMG4、LOG5 组的乳酸菌、好氧菌数量显著高于G组（P＜0.05）。

表3 西藏乡土乳酸菌和商品乳酸菌制剂对箭筈豌豆青贮饲料化学成分的影响

表4 西藏乡土乳酸菌和商品乳酸菌制剂对箭筈豌豆青贮饲料微生物数量的影响

2.4 西藏乡土乳酸菌和商品乳酸菌制剂添加组的费氏评分结果

根据费氏评分体系：优（＞80）、良（60～80）、一般（40～60）、差（20～40）、劣质（＜20）。 由图 1 可知，对照组评分最低，青贮品质评级为一般；G组评分为68.81，青贮品质评级为良；HG24组评分为78.03，青贮品质评级均为良，LMG4组和LOG5组评分为81.98、80.81，青贮品质评级为优。

图1 不同乳酸菌处理下箭筈豌豆青贮的费氏评分

3 讨论

乳酸菌是影响青贮发酵品质的重要因素。Lin等［12］研究表明，达到良好青贮发酵所需乳酸菌最低数量水平为105CFU/g。在自然青贮发酵中，乳酸菌在厌氧条件下利用水溶性碳水化合物生成以乳酸为主的有机酸，从而形成酸性厌氧环境保存饲料作物及牧草收获后营养成分，而作物附着的乳酸菌种类、数量及活性是影响青贮饲料发酵品质的重要因素［12-13］。该试验中对照组青贮饲料的氨态氮/总氮值、乙酸、总挥发性脂肪酸含量较高，乳酸含量较低，pH值为4.89，费氏评分为59.44，青贮品质评级为一般。这主要是因为箭筈豌豆表面附着乳酸菌的数量为 4.45 lg（CFU/g），发酵初期难以占据优势地位，发酵速度缓慢，乳酸生成量低，乙酸生成量高；另外牧草表面附着有大量的好氧菌、霉菌和酵母菌，有害菌数量远远高于牧草原材料上的乳酸菌量，致使蛋白质、葡萄糖等营养物质被分解，生成大量的氨态氮和总挥发性脂肪酸。因此，在添加乳酸菌可弥补青贮原料中乳酸菌数量的不足。

乳酸菌的添加可使青贮饲料发酵过程中乳酸菌急剧增殖，显著抑制霉菌、酵母菌以及一般细菌的增殖，快速积累乳酸，使青贮的pH值迅速下降，抑制丁酸菌的繁殖［14］。 吴晓杰等［15］添加乳酸菌研究其对早稻青贮饲料品质的影响，结果表明乳酸菌能有效地降低氨态氮/总氮值，改善青贮饲料的发酵品质。该试验中，各添加组pH值、氨态氮/总氮值均低于对照组，乳酸菌数量增多，均有效改善了箭筈豌豆青贮发酵品质。商品乳酸菌制剂添加组乳酸/乙酸值、乳酸含量均与对照组无显著差异，乙酸含量高于对照组。乙酸含量过高，表明发酵过程中水溶性碳水化合物的损失大，导致青贮饲料的营养价值降低，且具有一定的刺鼻气味，影响奶牛采食量。青贮饲料中的乙酸主要通过两种途径产生：一是异型乳酸菌发酵糖产生一分子的乳酸和一分子的乙酸；二是乳酸异化作用生成乙酸［13］。商品乳酸菌制剂添加组乙酸含量高，这可能因为商品乳酸菌难以适应西藏特殊气候条件，活性不及作物附着的乳酸菌，限制了其性能的发挥，导致乳酸异化作用生成乙酸；另外，作物附着的乳酸菌主要为异型乳酸菌，对照组的乙酸含量和pH值较高，乳酸含量低也说明了这一点。

在低pH值的青贮环境中可以抑制好氧菌、酵母菌和霉菌等有害微生物的生长，从而减少发酵过程中的营养损失，提高青贮饲料的品质。该试验中，各处理组青贮后好氧菌数均有所下降，但酵母菌数未明显减少。这种现象也出现在Xing等［16］添加酶和乳酸菌制剂的高粱青贮研究中。此外，Schmid等［17］研究显示，高浓度的水溶性碳水化合物促进酵母菌在低pH青贮环境中生长。在该研究中，箭筈豌豆高浓度的水溶性碳水化合物为酵母菌在低pH青贮环境中提供良好的生长环境，导致青贮饲料中营养物质（如蛋白质、水溶性碳水化合物、淀粉等）被分解，造成了青贮饲料营养的损失。

HG24、LMG4、LOG5是从西藏豆科牧草和农作物秸秆青贮饲料中筛选3种乡土乳酸菌，均属于同型发酵乳酸菌，在青贮过程中，发挥其适应性强的特性，迅速占据主导地位，生成大量乳酸，降低pH，减少蛋白质和氨基酸分解。一般认发酵品质良好的青贮饲料的pH值为4.2以下，氨态氮/总氮值小于 80 g/kg［18］。 但 Heinritz 等［19］认为对缓冲能高的热带苜蓿添加蔗糖和乳酸菌在青贮90 d后pH达4.9，其发酵品质评级可以达到优。同样，李向林等［20］指出适宜的水溶性碳水化合物含量可以克服原料较高的缓冲能，确保青贮质量。该试验中箭筈豌豆具有较高的缓冲能和充足的水溶性碳水化合物，在添加HG24、LMG4、LOG5乡土乳酸菌青贮之后，pH值分别降低到 4.41、4.29、4.38，其氨态氮/总氮值均低于80 g/kg，费氏评分分别为78.03、81.98、80.81，评级分别为良、优、优，同样可以确保青贮质量，与上述结论一致。

4 结论

综上所述，添加乳酸菌均能明显改善西藏箭筈豌豆的青贮发酵品质，乡土乳酸菌添加效果更佳，特别是乡土乳酸菌LMG4、LOG5，发酵品质最好，最适宜于西藏地区推广应用。