16味蒙药对3种血清型牛源致病性大肠杆菌体外抑菌及联合抑菌效果的研究

高瑞娟，王纯洁，敖日格乐，高思明

（1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）属肠杆菌科埃希氏菌属，为革兰阴性杆菌，特定血清型的大肠杆菌具有致病性。动物大肠杆菌病是指由大肠杆菌埃希氏菌属的某些致病性血清型菌株引起的动物疾病总称。该病一年四季均可发生，主要对犊牛、仔猪等幼龄动物威胁最大，从而造成严重的经济损失。从1982年开始，美国、英国、加拿大、澳大利亚、日本等国家多次发生大肠杆菌O157∶H7感染人的病例［1］，即便是在经济日益发达、食品污染控制技术日益成熟的现代社会，大肠杆菌在各国感染人的病例时有发生［2］。抗生素是治疗细菌感染性疾病的首选药物，但是由抗生素不合理使用导致的细菌耐药性问题已成为人类公共卫生安全面临的又一道难题，尤其是肠道中大量存在的致病菌，更容易引起耐药基因的传递。杨斯琴等［3］研究表明，不同血清型的牛源大肠杆菌对7～12种抗菌药物表现出耐药性，并且有10种血清型的致病性大肠杆菌对四环素、多西环素、利福平、复方新诺明和阿莫西林等抗菌药物表现出耐药性。此外，由于新型抗生素的研究与开发不但耗资、耗时，更重要的是其研制速度远不及耐药菌株形成的速度，因此，筛选、开发新型抗菌药物具有紧迫性。

蒙药具有悠久的历史，是蒙古民族传承的瑰宝，除了具有药用、保健、营养等作用外，还以低毒、残留少、耐药性发生率低等特点著称。此外，蒙药在抑菌和抗炎等方面均有良好的效果。吴海燕等［4］研究表明，小鼠对蒙药特润舒都乐复方最大耐受量达 120 000 mg/（kg·BW），基本无毒。研究表明，一些蒙药的抑菌活性高，且不易诱导细菌产生耐药性。杨斯琴等［3］研究表明，朱如拉、朝您—哈日莫各等7味蒙药对4种不同血清型致病性大肠杆菌均达到极敏和高敏。因此，研究和开发抗菌蒙药对解决耐药菌株的产生和新型抗生素短缺问题具有重要意义。

该研究拟选用乌里史古—达兰—哈力苏等16味具有清热、解毒、抗菌、消炎作用的蒙药作为研究对象，利用煎煮法提取药液，通过测定这些药物对3种血清型大肠杆菌的MIC和MBC来评价蒙药对致病性大肠杆菌的体外抑菌活性，从而筛选具有较好抗菌活性的蒙药，并通过体外联合抑菌试验推荐组方药物，以期为抗大肠杆菌蒙兽药的开发、利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1药材：蒙药乌里史古—达兰—哈力苏（金银花）、协日—洪连（黄连）、希木图—希木蕾（何首乌）、呼仍—图如（地榆）、乌拉勒吉嘎纳（五味子）、木合图—毛敦—哈力苏 （秦皮）、乃日—泰勒格其—额布苏（穿心莲）、希和日—乌布斯（甘草）、毕力格图—那布其（蒲公英）、宝日—吉如格（夏枯草）、舒布格日—希木勒德格（虎杖）、包日查—额布苏（柴胡）、协日—毛敦—道日素（黄柏）、道古勒—乌布斯（苦参）、阿纳尔（石榴皮）、呼胡日格那—温都苏（板蓝根）均购自内蒙古呼和浩特市天力药业有限公司。所有药物经鉴定均符合生药质量标准。

1.1.2受试菌株：致病性大肠杆菌 O26、O83、O145均由内蒙古农业大学动物科学学院牛生产实验室从腹泻犊牛粪便中分离、鉴定。

1.1.3仪器与试剂：超净工作台，上海新苗医疗器械制造有限公司产品；生化培养箱 （型号为JCSPJ-480），济南精诚实验仪器有限公司产品；全自动立式电热压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂产品。电子分析天平 （型号为CP224C），微量移液，无菌玻璃平皿，无菌牛津杯，无菌96孔板，电炉、漏斗等实验室常用器材。甘露醇琼脂培养基、营养琼脂培养基、营养肉汤培养基，伊红美蓝培养基等购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1蒙药提取液的制备：采用水提法。将蒙药粉碎成末后分别称取各单味蒙药50 g倒入滤药袋，加入500 mL蒸馏水室温浸泡过夜，大火煮沸后文火煮1 h，8层纱布过滤药液，滤渣中加入250 mL蒸馏水，煮沸30 min，过滤后合并2次药液，小火浓缩至50 mL（即药液中所含生药量为1 g/mL）。装瓶、标记，121℃高压灭菌，置于4℃冰箱备用［5］。

1.2.2菌悬液的制备：将冻存于-80℃冰箱中的E.coli O26、O83、O145在营养肉汤中复苏、增殖、纯化后保存于琼脂斜面。将纯化后的细菌接种在琼脂培养基上，37℃、5%CO2恒温培养20 h后，用3 mL无菌生理盐水将菌苔洗下，收集于无菌试管中（即原菌液）。将原菌液10倍稀释5个梯度。于630 nm波长下测定菌液OD值。OD值在0.08～0.10的菌液浓度为 1×108cfu/mL。

1.2.3牛津杯法抑菌试验：于超净工作台内，取调好的1.0×108cfu/mL菌液100 μL均匀涂布于无菌琼脂表面。无菌操作将高压灭菌的牛津杯放置于带有菌层的平皿内，将200 μL的药液加入牛津杯内，放置于4℃冰箱中过夜（使药液在琼脂上均匀扩散），于37℃恒温箱中培养18 h。用游标卡尺测量抑菌圈直径。每种药物做3个平行，结果取平均值［6］。 抑菌圈直径（R）≥15 mm，判定为极敏；10 mm≤R＜15 mm， 判定为高敏；8 mm≤R＜10 mm 判定为低敏；R＜8 mm为不敏感。

1.2.4MIC及MBC测定：采用微量稀释法和平板法，取96孔板，每排1～8孔为试验孔，加入用肉汤2倍稀释的药液，每孔200 μL，设阳性对照孔（第9孔，不加药物）和阴性对照孔（第10孔，不加菌液）。在第 1～9孔中加入 100 μL稀释好的 1.0×108cfu/mL菌液。振荡混匀后放置于37℃恒温箱培养24 h，观察培养结果。以阴性对照孔和阳性对照孔作为参照判定结果。无细菌生长且药物浓度最低者即为该味蒙药对该菌株的最低抑菌浓度（MIC）。从未见细菌生长的各孔取100 μL混合液均匀涂布于营养琼脂上，37℃培养24 h，生长的菌落数小于5～10个的最低药液浓度为最低杀菌浓度（MBC）［7］。MIC＜7.80 mg/mL，判定为高度敏感；7.80 mg/mL≤MIC≤250 mg/mL，判定为中度敏感；MIC＞250 mg/mL，判定为不敏感［8］。

表1 16味蒙药对大肠杆菌O26、O83、O145的体外抑菌直径测定结果mm

1.2.5体外联合抑菌试验：将1.2.3和1.2.4中筛选出的对致病性大肠杆菌O26、O83、O145抑菌效果较好的蒙药，用无菌肉汤倍比稀释成2×MIC、MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIIC 共 5个梯度。将制备好的蒙药按棋盘法设计，测定MIC［9］。观察结果并计算协同指数FICI。FICI=MIC（甲药联合）/MIC（甲药单药）+MIC （乙药联合）/MIC （乙药单药）。FICI≤0.50，判定为协同作用；0.50＜FICI≤1.00，判定为累加作用；1.00≤FICI≤2.00，判定为无关；FICI＞2.00，判定为颉颃作用。

2 结果与分析

2.1 16 味蒙药对致病性大肠杆菌 O26、O83、O145抑菌圈直径测定结果

由表1可知，大肠杆菌O26对乌里史古—达兰—哈力苏、协日—洪连、乌拉勒吉嘎纳极度敏感，其抑菌圈直径分别为19.80、20.74、24.46 mm，对木合图—毛敦—哈力苏、毕力格图—那布其、宝日—吉如格高度敏感，其抑菌圈直径分别为13.08、11.50、12.04 mm，对希和日—乌布斯、包日查—额布苏、乃日—泰勒格其—额布苏等其他蒙药不敏感；大肠杆菌O83对乌里史古—达兰—哈力苏、协日—洪连、乌拉勒吉嘎纳极度敏感，其抑菌圈直径分别为16.10、29.64、23.47 mm，对木合图—毛敦—哈力苏、毕力格图—那布其、宝日—吉如格低度敏感，其抑菌圈直径分别为8.46、8.68、9.94mm，对希和日—乌布斯、包日查—额布苏、乃日—泰勒格其—额布苏等其他蒙药不敏感；大肠杆菌O145对乌里史古—达兰—哈力苏、协日—洪连、乌拉勒吉嘎纳极度敏感，其抑菌圈直径分别为21.76、28.51、24.74 mm，对木合图—毛敦—哈力苏、毕力格图—那布其、宝日—吉如格高度敏感，其抑菌圈直径分别为13.82、11.62、11.74 mm，对希和日—乌布斯、包日查—额布苏、乃日—泰勒格其—额布苏等其他蒙药不敏感。

表2 16种蒙药对致病性大肠杆菌O26、O83、O145的MIC和MBC测定结果mg/mL

表3 敏感蒙药对致病性大肠杆菌O26的FICI计算结果

2.2 16味蒙药对致病性大肠杆菌 O26、O83、O145 MIC和MBC测定结果

由表2可知，大肠杆菌O26对乌里史古—达兰—哈力苏、协日—洪连、希木图—希木蕾、呼仍—图如、乌拉勒吉嘎纳、木合图—毛敦—哈力苏、毕力格图—那布其、宝日—吉如格、舒布格日—希木勒德格、阿纳尔中度敏感，各药物对大肠杆菌 O26的 MIC 为 15.63～250 mg/mL，MBC 为125～500 mg/mL；大肠杆菌O83对乌里史古—达兰—哈力苏、协日—洪连、希木图—希木蕾、呼仍—图如、乌拉勒吉嘎纳、乃日—泰勒格其—额布苏、阿纳尔中度敏感，各药物对大肠杆菌O83的MIC 为 15.63～250 mg/mL，MBC 为 125 mg/mL （希木图—希木蕾未测出）；大肠杆菌O145对乌里史古—达兰—哈力苏、协日—洪连、希木图—希木蕾、呼仍—图如、乌拉勒吉嘎纳、木合图—毛敦—哈力苏、毕力格图—那布其、宝日—吉如格、协日—毛敦—道日素、阿纳尔对中度敏感，各药物对大肠杆菌O145的 MIC为7.81～250 mg/mL，MBC为15.63～500 mg/mL。

2.3 敏感蒙药对致病性大肠杆菌O26、O83、O145FICI测定结果

由表3可知，对于大肠杆菌O26，乌里史古—达兰—哈力苏与协日—洪连、呼仍—图如，呼仍—图如与协日—洪连、乌拉勒吉嘎纳的FICI均为2.25～4.00，表现为颉颃作用；乌里史古—达兰—哈力苏与乌拉勒吉嘎纳，协日—洪连与舒布格日—希木勒德格的FICI为0.75，表现为累加作用；协日—洪连与乌拉勒吉嘎纳，呼仍—图如与舒布格日—希木勒德格的FICI为0.50，表现为协同作用；舒布格日—希木勒德格与乌里史古—达兰—哈力苏、乌拉勒吉嘎纳的FICI为1.00～1.50，表现为无关作用。由表4可知，对于大肠杆菌O83，乌里史古—达兰—哈力苏与协日—洪连、呼仍—图如，协日—洪连与呼仍—图如的FICI为1.00～1.25，表现为无关作用；乌拉勒吉嘎纳与协日—洪连、呼仍—图如的FICI为2.25，表现为颉颃作用；乌里史古—达兰—哈力苏与乌拉勒吉嘎纳的FICI为0.50，表现为协同作用。由表5可知，对于大肠杆菌O145，乌里史古—达兰—哈力苏与协日—洪连、乌拉勒吉嘎纳的FICI为1.25，表现为无关作用；阿纳尔与协日—洪连、呼仍—图如、乌拉勒吉嘎纳的FICI为1.25，表现为无关作用；乌里史古—达兰—哈力苏与呼仍—图如、阿纳尔的FICI为2.25，表现为颉颃作用；乌拉勒吉嘎纳与协日—洪连、呼仍—图如的FICI为3.00，表现为颉颃作用；协日—洪连与呼仍—图如的FICI为1.00，表现为累加作用。

表4 敏感蒙药对致病性大肠杆菌O83的FICI计算结果

表5 敏感蒙药对致病性大肠杆菌O145的FICI计算结果

3 讨论

该研究结果表明，16味蒙药对3种血清型致病性大肠杆菌表现出不同的抗菌作用。当药物浓度为1 g/mL时，乌里史古—达兰—哈力苏、协日—洪连、乌拉勒吉嘎纳、希木图—希木蕾、呼仍—图如、阿纳尔对致病性大肠杆菌O26、O83、O145的MIC为7.81～250 mg/mL，均表现出较好的抑菌作用，组方时可优先考虑。此外，该研究还发现，不同单味蒙药对同种血清型细菌的抑菌作用存在差异，究其原因可能与菌种的毒力有关［5-6］。

不同研究者对同一种药物体外抑菌效果的研究结果不同。陈微等［9］报道黄柏对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有很好的抑菌活性，但在该研究中，协日—毛敦—道日素（黄柏）对大肠杆菌O26、O83、O145的抑菌效果并不好，这可能与药液的pH值及菌种自身毒力有关。陈辉等［10］研究表明，不同pH值的药液对同一种细菌的抑菌效果存在较大差异。代如意等［8］报道了虎杖对鸡白痢沙门菌具有很好的抑杀效果，但该研究中舒布格日—希木勒德格（虎杖）仅对大肠杆菌O26表现出明显的抑菌作用，对大肠杆菌O83、O145无抑菌作用，结果不同的原因可能是由于药物提取方式和提取剂不同导致。代如意等［8］用乙醇提取药物浓缩浸膏，而该研究采用的是基础水提液，该种方法可能会导致药物抗菌有效成分析出不全，使药物抑菌效果降低。有研究表明，草药的提取工艺、提取剂分别决定和影响药液的成分及其含量［11］。 陈辉等［10］研究发现，五味子对溶藻弧菌的抑菌作用达到极敏，与该研究结果基本相同。该研究的2个体外抑菌试验结果均表明，乌拉勒吉嘎纳（五味子）对大肠杆菌O26、O83、O145的体外抑菌作用均达到极敏或中敏。陈辉等［10］的进一步研究指出，五味子的酸性提取液抑菌效果强于碱性提取液，所以笔者推测五味子的抑菌作用可能与其提取物中的酸性物质有关。

该研究同时采用牛津杯和微量稀释2种方法来评价16味蒙药对致病性大肠杆菌O26、O83、O145的抑菌效果，2种方法的结合分别从定性和定量角度准确检测药物的抑菌效果，避免了单独使用一种方法对试验结果造成的片面性［12］。由试验结果可知，2种方法测得16味蒙药的抑菌效果大部分相同，但也存在一定差异。杨斯琴等［13］、阿琪玛等［14］研究表明，微量稀释和牛津杯法测定药物体外抑菌效果的试验结果大致相同，但存在一定差异，研究结果与该研究结果一致。该研究在测定药物抑菌圈结果时发现，希木图—希木蕾、呼仍—图如、舒布格日—希木勒德格、阿纳尔4味蒙药水提液不能渗入培养基中，导致4味蒙药没有出现抑菌圈，所以牛津杯法不能确定这4味蒙药有无抑菌作用；但在微量稀释法中，希木图—希木蕾、呼仍—图如、舒布格日—希木勒德格、阿纳尔4味蒙药均有抑菌作用，其MIC为31.25～250 mg/mL，其中呼仍—图如和舒布格日—希木勒德格的MIC达到31.25 mg/mL，表现出很好的抑菌作用，所以微量稀释法弥补了牛津法的不足。2种体外试验结果不同的原因可能与药物溶解度有关。在抑菌圈测定试验中，牛津杯中的药物如果不能渗入培养基，药物无法发挥抑菌作用，但微量稀释法不受药物溶解度的影响，在96孔板中，药物和细菌充分混匀，加大了药物和细菌的接触面积，药效可以充分发挥。在微量稀释法中，药物与细菌直接接触产生对抗作用，这与体内药物作用模式相似，易于反映临床应用效果，且药物的MIC还可指导临床用药剂量［15］。

该研究结果表明，不同蒙药水提液对不同血清型大肠杆菌均表现出不同的联合效应，乌里史古—达兰—哈力苏、协日—洪连、呼仍—图如、乌拉勒吉嘎纳、舒布格日—希木勒德格5味蒙药对大肠杆菌O26均有一定的抑菌作用，MIC范围在15.63～31.25 mg/mL，其中乌拉勒吉嘎纳与协日—洪连，舒布格日—希木勒德格与呼仍—图如的FICI为0.50，有协同作用，组方时可优先选用上述药物。

蒙药对病原菌的抑制效果衡量标准由体外的药物对细菌抑菌圈、MIC、MBC的测定和体内免疫机能的测定组成。该研究获得了16味蒙药对3种血清型致病性大肠杆菌体外抑菌作用及敏感蒙药联合抑菌效果的数据，为今后寻求高效且适合临床应用的治疗药物奠定了前期基础，同时也为蒙药组方制剂的研究奠定了基础，对今后实际生产中动物大肠杆菌病的预防与治疗具有一定的指导意义。