球形孢子丝菌黑素抵御抗真菌药物杀伤作用的研究

崔岩 李珊山 侯媛媛 宋洋 陈瑞丽 李洪霞

(1.吉林大学第一医院皮肤性病科，长春 130021；2.吉林大学第一医院儿科，长春 130021)

黑素(melanin)是一种耐酸、耐热、带负电荷的疏水性大分子聚合物，是真菌重要的毒力因子之一，致密地覆盖于细胞壁表面。现已发现，黑素可通过抵御活性氧簇(ROS)、紫外线、重金属离子的杀伤以及降低巨噬细胞的吞噬等多种途径保护菌体，使之能在不利环境中生长[1]。

球形孢子丝菌(Sporothrixglobosa)可以通过1，8-二羟基萘(dihydroxynaphthalene，DHN)途径、L-多巴(L-dihydroxyphenylalanine，L-DOPA)途径和酪氨酸(L-tyrosine)途径合成黑素。S.globosa作为双相型真菌(即在环境中为菌丝相，在机体内为酵母相引发感染)，无论在酵母相或是菌丝相均可合成黑素，可见黑素对于致病性孢子丝菌的生存十分重要[2]。最近研究发现，黑素可以降低申克孢子丝菌(S.schenckiisenusstricto)和巴西孢子丝菌(S.brasiliensis)对特比萘芬、两性霉素B的敏感性[3，4]，但对于S.globosa的作用尚无报道。因此本文利用紫外照射法诱导的S.globosa白化突变株(MEL-)与黑素野生株(MEL+)，检测对4种常见抗真菌药的敏感性并探讨黑素对抗真菌药物的作用。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

Sporothrixglobosa(FHJU 12082703)黑素野生株(MEL+)分离自孢子丝菌病临床患者皮损组织(CAL基因序列GenBank登录号为KT008664)，其白化突变株(MEL-)由吉林大学第一医院皮肤科实验室构建并提供[5]。

1.2 主要试剂

氟康唑(Fluconazole，FCZ)、特比萘芬(Terbinafine，TRB)、伊曲康唑(Itraconazole，ICZ)购自加拿大Tokyo Chemical Industry，两性霉素B(Amphotericin B，AMB)购自加拿大BBI公司。纤维素酶、蜗牛酶、溶壁酶购自美国Genview公司。蛋白酶K购自美国Invitrogen公司。

1.3 体外药敏实验

利用琼脂平板法检测MEL+和MEL-，对4种抗真菌药FCZ、TRB、ICZ和AMB的药物敏感性。将保存的MEL+和MEL-菌接种至Potato Dextrose Agar(PDA)，28℃活化7 d。加入含0.5 % Tween 80的生理盐水配置成终浓度为2×102 CFU/mL的孢子悬液，取100 μL涂布于含有不同浓度梯度的抗真菌药物琼脂平板上，30℃培养72 h后菌落计数。每种抗真菌药为倍比稀释，各含5个药物浓度，浓度范围分别为FCZ 1 ～16 μg/mL；TRB 0.025 ～ 0.4 μg/ml；AMB 1 ～16 μg/mL；ICZ 0.0625～ 1 μg/mL。不含抗真菌药物的琼脂平板作为阴性对照。实验重复3次。按生存率=(含药平板菌落数/不含药菌落数)×100%，进行数据统计分析。

1.4 黑素的制备

按照宋洋[5]的方法制备S.globosa黑素，将活化的MEL+菌丝相接种至Potato Dextrose Broth(PDB)液体培养基中，28℃，120 r/min，震荡培养2个月。8层纱布过滤后离心获得分生孢子。加入含浓度均为10 mg/mL纤维素酶、蜗牛酶和溶壁酶的1.0 mol/L山梨糖醇-0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液，30℃震荡消化过夜。离心并PBS洗涤3次，弃上清，加入4.0 mol/L硫氰酸胍溶液，室温震荡过夜。离心并PBS洗涤3次，蛋白酶K 37℃消化过夜，PBS洗涤3次，6.0 mol/L盐酸煮沸1h。取上层黑色悬液，PBS，震荡洗涤，离心取上层悬液，共3次。静置，每日洗涤一次，至黑素颗粒逐渐沉淀后，离心，弃上清，光镜下观察。

1.5 紫外分光光度法检测

利用紫外分光光度计检测黑素对抗真菌药物浓度的影响。取上述方法制备的100 μL黑素分别加入用甲醇溶解的4种抗真菌药物，至终体积为200 μL，药物终浓度分别为TRB 25 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL；FCZ 50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL；ICZ和AMB 5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL，于30℃，震荡孵育12 h和24 h，0.22 μm有机系滤膜过滤后按照2010版中国药典分别检测吸光度(TRB检测波长为282 nm，FCZ和ICZ检测波长为259，AMB检测波长405 nm)。阴性对照组为不含黑素的等体积抗真菌药液，空白对照组为等体积黑素。

1.6 高效液相色谱法检测

利用高效液相色谱法(HPLC)检测黑素对AMB的作用。配置浓度为128 μg/mL的AMB作为母液，分别取100 μL、50 μL、30 μL药液，加入黑素补足200 μL。30℃，震荡孵育24h后，0.22 μm有机系滤膜过滤，利用Agilent 1260高效液相色谱仪检测(美国安捷伦公司)。色谱条件如下[6]，色谱柱：Extend-C18柱，(5μm，250 mm×4.6mm)；流动相：(A)乙腈，(B)2.5 mmol/L EDTA；检测波长：383nm；柱温：30℃；流速：1 mL/min；进样量：精密吸取供试品溶液20μL；梯度洗脱时间：0 ～ 15 min，A液为30%，B液为70%，16 min及以后，A液为100%。黑素和AMB母液各200 μL。实验重复3次。

1.7 统计分析

利用SPSS 18.0软件，采用Student t检验进行统计学差异分析，P<0.05认为差异具有统计学意义。利用Graphpad Prism 5软件将数据绘制柱形图。

2 结果与分析

2.1 体外药敏实验

菌株MEL+和MEL-分别接种于不同浓度梯度的含药琼脂平板上，30℃培养72h后，肉眼计菌落数。与对照组相比，计算生存率。结果如图1显示，MEL+在ICZ和TRB的含药平板上，随着药物浓度的降低，生存率逐渐升高，在ICZ浓度为0.5 μg/mL和1 μg/mL时不生长，而对于AMB和FCZ的各个浓度间无显著差异，生长率接近100%。MEL-则在AMB和TRB含药平板上随着药物浓度的降低，生存率逐渐升高，而在ICZ含药平板的各个浓度上均未生长。在AMB的4～16 μg/mL和ICZ的0.06～0.25 μg/mL浓度间，MEL-生存率小于MEL+，差异具有统计学意义。

图1抗真菌药物敏感性实验(*P<0.05，**P<0.01)

Fig.1Antifungal drug susceptibility test(*P<0.05，**P<0.01)

2.2 紫外分光光度法检测

将不同的抗真菌药液与黑素孵育12h或24h后，利用紫外分光光度计检测药液的吸光度，观察浓度的变化情况。结果显示(图2)，药液加入黑素孵育12 h和24 h后，药液浓度均呈现不同程度的降低。而AMB所有浓度均显著降低(p<0.01)，TRB为100 μg/mL时，差异具有统计学意义(P<0.05)。ICZ孵育12 h后，10 μg/mL和20 μg/mL有差异(P<0.05)，孵育24 h时，仅20 μg/mL差异显著(P<0.01)。FCZ在所有浓度均无差异(P>0.05)。

2.3 高效液相色谱法检测

为了观察AMB加入黑素的变化情况，我们利用HPLC进行检测。结果如图3所示，AMB在C-18柱、检测波长为383 nm时，保留时间约为5.2 min左右(图3-A)，而在此时黑素几乎无吸收(图3-E)。随着药液浓度的降低和黑素浓度的升高，在保留时间为3.8 min、4.2 min和4.7 min左右出现吸收峰，尤其在50 μL AMB + 150 μL黑素(图3-C)和30 μL AMB + 170 μL黑素(图3-D)，峰形变化明显。

图2球形孢子丝菌黑素对抗真菌药物浓度的影响(*P<0.05，**P<0.01)

Fig.2The effect ofSporothrixglobosamelanin on concentration of antifungal drugs(*P<0.05，**P<0.01)

3 讨论

根据合成途径的差异，黑素可分为3种：DHN-melanin、eumelanin(L-DOPA途径)、promelanin(L-tyrosine途径)[3]。目前研究发现，新生隐球菌(Cryptococccusneoformans)[7]、巴西副球孢子丝菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)[8]、组织荚膜胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)[7]和马内菲篮状菌(Talaromycesmarneffei)[9]可利用eumelanin抵御抗真菌药物的杀伤，而足马杜拉分支杆菌(Madurellamycetomatis)和烟曲霉(Aspergillusfumigatus)则依赖于DHN-melanin[10]。现已证实，致病性孢子丝菌包括S.brasiliensis、S.schenckiisenusstricto和S.globosa，无论酵母相或是菌丝相，均可通过上述3种途径合成黑素[2]，而且合成黑素的能力越强，菌株侵袭力越强[11]。最新的研究发现，孢子丝菌复合体之一，卢艾里孢子丝菌(S.luriei)的菌丝相只能合成pyomelanin，而酵母相不能合成任何种类的黑素，S.luriei几乎不致病或许与此相关[12]。

图3高效液相色谱图：A：128 μg/mL AMB ；B：100 μL， 128 μg/mL AMB + 100 μL 黑素；C：50 μL， 128 μg/mL AMB + 150 μL黑素；D：30 μL， 128 μg/mLAMB + 170 μL 黑素；E：200 μL 黑素

Fig.3HPLC chromatogram：A：128 μg/mLAMB ；B：100 μL 128 μg/mL AMB + 100 μLmelanin；C：50 μL， 128 μg/mL AMB + 150 μL melanin；D：30 μL， 128 μg/mLAMB + 170 μL melanin；E：200 μL melanin

Mario[4]通过向培养基添加黑素前体的方式，首次证明黑素具有保护S.brasiliensis、S.schenckiisenusstricto抵御AMB杀伤的作用。Rodrigo[3]则通过添加黑素合成抑制剂三环唑发现，黑素可以抵御TRB的杀伤，但是由于三环唑的抑制作用广泛，因而无法明确是哪种黑素发挥作用。我们利用紫外照射诱变法构建的白化突变株，直接证明了黑素可以保护菌株对抗真菌药物的杀伤。在前期实验中，我们采用了CLSI推荐的液基微量稀释法，但是结果显示MEL-在RPMI 1640为液基培养的时间过长，对照组需要5 d才能完全生长，而此时MEL+则生长过度，无法读取MIC值，因而改用含药平板涂布法，通过计菌落数的比值进行分析。在以往微量稀释法的药敏试验中，TRB的MIC值(0.03 ～ 0.06 μg/mL)远低于ICZ(0.25 ～ 1 μg/mL)，但结果显示含药平板涂布法对TRB的抑菌作用影响最大[13，14]，提示该方法可能影响了TRB的生物利用度。FCZ和ICZ同属唑类化合物(主要通过抑制真菌细胞色素P450对羊毛固醇14α脱甲基作用，从而抑制麦角固醇的合成)，区别只在于两者对细胞色素P450的作用位点不同[15]。结果显示，FCZ对MEL+和MEL-的生长均无抑制作用，这与微量稀释法的药敏结果相似，不仅印证了S.schenckiisenuslato对FCZ是天然耐药，而且表明MEL-中FCZ的作用靶点未发生突变。与MEL+相比，MEL-对AMB和ICZ较为敏感，差异具有统计学意义，尤其是对ICZ，在0.06 ～ 1 μg/mL范围内均未生长，表明黑素具有保护S.globosa抵御AMB和ICZ的作用，这可能是由于黑素的缺失，增加了AMB和ICZ在真菌细胞内的浓度，使药物杀伤效率增加，提示使用抗黑素合成类的药物(三环唑)会增加抗真菌药物的作用，即两者的关系为协同作用，Almeida-Paes[3]和Mario[4]的实验结果也不同程度地证实了该假设。在本实验中，由于在培养过程中未添加任何前体物，因此可能是DHN-melanin发挥了作用，但是不排除S.globosa其他类型的黑素也具有相同功能，这需要进一步实验验证。

有文章推测[16]，黑素可能通过吸附或转化抗真菌药物，降低细胞内药物浓度，从而保护菌株。为了探讨黑素抵御抗真菌药的作用机制，我们利用紫外分光光度法检测了黑素对抗真菌药物浓度的影响。结果显示，黑素对各组抗真菌药物12h和24h的作用结果相似，均对FCZ的浓度无影响，但可明显降低AMB各组以及ICZ和TRB高剂量组的浓度。黑素对AMB浓度影响更显著，这可能由于一方面AMB可直接与真菌细胞膜的麦角固醇结合，形成孔道，导致细胞离子外泄，引起真菌死亡[17]。而AMB为多烯类化合物，分子量较大，因此黑素对于AMB的转运和吸收影响最大。同时黑素可通过屏蔽作用，降低AMB对麦角固醇的结合。另一方面，AMB本身具有黄色，对紫外分光光度法的检测较为敏感。为了进一步确定黑素对AMB的作用方式，我们利用HPLC法对产物进行了检测。图谱显示，与对照组相比，加黑素组出现了新峰，并且与AMB特征峰相邻，可能表明黑素对AMB进行了转化。下一步可尝试利用质谱对其结构进一步分析。

综上，我们发现球形孢子丝菌黑素能够抵御AMB和ICZ对菌株的杀伤，并提示黑素可能对AMB进行转化，从而降低药物浓度。