可食性壳聚糖复合涂膜对干豆腐货架期的影响

左丽丽，王爽，金芝苹，陈银梅，闫旭，富校轶

（吉林医药学院公共卫生学院，吉林吉林132013）

大豆作为我国主要的粮食产物，是蛋白质的主要 来源[1]，随着人们对其营养价值的研究和保健功能的认识，豆制品越来越受到消费者青睐[2]。在生产制作的所有豆制品中，干豆腐味道鲜美，价格低廉，深受人们的喜爱。干豆腐根据薄厚程度的不同可分为三类：豆片（厚度为 10 mm～20 mm）、百叶（厚度为 2 mm左右）、千张（厚度为0.5 mm左右）[3-4]，是一种薄片白豆腐干类制品，具有一定的韧性和弹性。干豆腐含有丰富的优质蛋白质、不饱和脂肪酸、钙磷、铁等无机盐及B族维生素等多种营养成分[5]，其中干豆腐中的豆腐蛋白属于完全蛋白，不仅含有人体必需的8种氨基酸，而且其比例也接近人体需要，营养价值极高[6-7]。作为一种传统大豆制品，干豆腐在全国各个地区均有生产和销售，但其中产销量最大的为东北地区，东北地区生产的干豆腐具有香、鲜、嫩、薄、韧等特点，是当地居民平时餐桌上的必备佳肴[8]。目前，由于干豆腐加工场所简陋，卫生状况差，易受到金黄色葡萄球菌等微生物的污染，在无包装无冷藏的情况下，干豆腐的质量受到严重影响[9-10]。因此为了解决干豆腐易变质的问题，新型传统大豆制品保鲜技术的改造势在必行。

壳聚糖是一种天然多糖高分子化合物，具有良好的成膜性、溶解性和一定的抑菌性，能与多种聚合物进行混合，起到改善复合膜理化性质的作用，如甲基纤维素、明胶和淀粉[11-12]。柠檬酸是一种络合剂，起着协同抗氧化作用，能够有效阻止食物氧化酸败。添加一定量的氯化钙有利于改善干豆腐的质地和色泽，诱导膜的凝结。将壳聚糖、柠檬酸等食品添加剂制成干豆腐涂膜保鲜液，将干豆腐样品进行浸泡处理，可使产品与病原菌隔离，减少细菌的接触侵染，可以更好地确保干豆腐的品质。本研究拟通过壳聚糖保鲜涂膜液配比、包装方式和涂膜后存储的温度找出最佳涂膜保鲜配方和工艺，以延长干豆腐货架期。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干豆腐：欧亚综合体超市，市售新鲜。

可食性复合涂膜保鲜剂：吉林医药学院食品工艺实验室加工研制，主要成分壳聚糖（食品级90%脱乙酰度）、柠檬酸、Nisin、氯化钙（均为食品级）等。

1.2 仪器和设备

DNP-9022恒温培养箱：上海三发科学仪器有限公司；GR60DA高压蒸汽灭菌锅：致微（厦门）仪器有限公司；HHS型电热恒水浴锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；FA/JA系列电子分析天平：上海越平有限公司；CJ-2D超净工作台：天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 干豆腐的预处理

新鲜干豆腐在沸水中热烫5 s，在室温条件下放入保鲜密封包装袋备用。

1.3.2 涂膜处理

取一定比例的壳聚糖、柠檬酸、Nisin、氯化钙和甘油加水定容，加热溶解成胶状后，在80℃水浴中，将处理后的干豆腐浸入，浸泡时间为2 min，使干豆腐表面均匀覆盖涂膜液形成薄膜，冷却凝固后，将涂膜后的干豆腐置于无菌保鲜袋中常温保存。同时在80℃水浴中浸泡2 min未涂膜处理的干豆腐，冷却后置于无菌保鲜袋中常温保存，作为对照组样品。

具体制作步骤及操作要点：干豆腐→分切→热烫处理→涂膜→冷却→装袋→常温贮藏

1.3.3 单因素试验

试验以干豆腐保鲜为研究对象，以菌落总数为考查指标，对壳聚糖、柠檬酸、Nisin、氯化钙的不同添加量进行单因素试验，在80℃下涂膜2 min，并对涂膜处理后的干豆腐进行保鲜密封包装。

1.3.3.1 壳聚糖添加量的确定

分别配制不同浓度（1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%）的壳聚糖溶液，添加0.9%的柠檬酸，0.03%的Nisin，1%的氯化钙以及1%的甘油，制成复合涂膜液后在80℃下对干豆腐进行涂膜2 min，分别从菌落总数和感官指标对其进行评价，从而确定壳聚糖的添加量。

1.3.3.2 柠檬酸添加量的确定

选取1.3.3.1中壳聚糖的最佳添加量M1，分别配制不同浓度（0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%的）的柠檬酸溶液，添加0.03%的Nisin，1%的氯化钙以及1%的甘油，制成复合涂膜液后在80℃下对干豆腐进行涂膜2 min，分别从菌落总数和感官指标对其进行评价，从而确定柠檬酸的添加量。

1.3.3.3 Nisin添加量的确定

选取1.3.3.1中壳聚糖的最佳添加量M1，1.3.3.2柠檬酸最佳添加量M2，分别配制不同浓度（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%）的Nisin溶液，添加1%的氯化钙以及1%的甘油，制成复合涂膜液后在80℃下对干豆腐进行涂膜2 min，分别从菌落总数和感官指标对其进行评价，从而确定Nisin的添加量。

1.3.3.4 氯化钙添加量的确定

选取1.3.3.1中壳聚糖的最佳添加量M1，1.3.3.2中柠檬酸最佳添加量M2，1.3.3.3中Nisin最佳添加量M3，分别配制不同浓度（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）的氯化钙溶液，添加1%的甘油，制成复合涂膜液后在80℃下对干豆腐进行涂膜2 min，分别从菌落总数和感官指标对其进行评价，从而确定氯化钙的添加量。

1.3.4 可食性壳聚糖复合涂膜的正交试验设计

为确定可食性壳聚糖复合涂膜的最佳工艺配方，在单因素试验的基础上，选取对干豆腐保鲜影响显著的 4个因素壳聚糖（A）、柠檬酸（B）、Nisin（C）、氯化钙（D），每个因素设置3个水平进行正交试验分析，采用L9（34）正交试验设计，考察各因素对可食性壳聚糖复合涂膜菌落总数和感官指标的影响，对材料配方进行优化，最终确定干豆腐保鲜的最佳配比。正交试验因素水平如表1所示。

表1 正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.5 检验方法及指标

菌落总数测定：单因素试验和正交试验均采用菌落总数来衡量干豆腐的货架期。菌落总数是干豆腐新鲜程度的检测指标。一般来讲，菌落总数可作为食品被污染程度的标志，菌落数越多，食品的污染程度越严重；另外菌落总数也可预测食品的保鲜期限。菌落总数指标参考GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[13]。

感官评价：观察贮藏后干豆腐的组织状态、色泽、软硬度、豆香味等感官标准，评价标准见表2。

表2 感官评价标准Table 2 Sensory evaluation criteria

检测方法：感官小组由10名年龄在18岁至40岁之间的消费者组成。取适量式样置于洁净的搪瓷盘中，在自然光下观察色泽、组织状态（成片性、干湿情况、黏附性）和杂质等，闻其气味（豆香味、豆腥味），用温水漱口，品尝滋味（口感、咀嚼性）。综合10位评价员每次产生的描述语，删除快感术语、定量术语、无关术语并总结反映相同性质的描述词，保留出现频率在50%以上的术语，作为最后确定的干豆腐感官特征的描述语，然后对干豆腐样品进行感官评价。

2 结果与分析

根据国标对各种添加剂使用量的要求以及本课题组前期的研究，分别选取不同材料的不同添加量进行单因素试验。能产生孢子的多数革兰氏阳性菌是引起食品腐败的主要原因，Nisin对梭菌和芽孢杆菌具有很强的抑制作用[14-15]，壳聚糖、柠檬酸在食品的应用中起到一定的防腐作用，可作为食品防腐剂。甘油作为增塑剂，氯化钙作为干燥剂和固化剂。

2.1 单因素试验

2.1.1 壳聚糖添加量对干豆腐保鲜效果的影响

壳聚糖的添加量对干豆腐保鲜效果的影响如表3所示。

表3 壳聚糖添加量对干豆腐保鲜效果的影响Table 3 The chitosan content for dried bean curd preservation effect

试验组的菌落总数＜对照组2.1×105CFU/g，壳聚糖添加量为1.2%和1.4%的干豆腐菌落数较多，导致保鲜时间短，而添加量为1.6%和1.8%的菌落数较少，保鲜效果较优，2.0%的成膜较厚、较硬，影响感观。因此选取壳聚糖添加量为1.8%进行后续试验。

2.1.2 柠檬酸添加量对干豆腐保鲜效果的影响

柠檬酸的添加量对干豆腐的保鲜效果的影响如表4所示。

表4 柠檬酸添加量对干豆腐保鲜效果的影响Table 4 The effect of citric acid addition on the preservation effect of dried bean curd

试验组的菌落总数＜对照组2.1×105CFU/g，柠檬酸添加量为0.3%和0.6%的干豆腐成膜不均，影响感官。而添加量为0.9%和1.2%的菌落数较少，成膜均匀，保鲜效果较优。1.5%的柠檬酸添加量过多，影响口感。因此选取柠檬酸添加量为1.2%进行后续试验。

2.1.3 Nisin添加量对干豆腐保鲜效果的影响

Nisin添加量对干豆腐保鲜效果的影响如表5所示。

表5 Nisin添加量对干豆腐保鲜效果的影响Table 5 The effect of Nisin addition on the preservation effect of dried bean curd

在整个贮存期间，对照组储存1天后的菌落数就达到2.1×105CFU/g，Nisin添加量为0.01%和0.02%的干豆腐菌落总数多，保鲜时间短，而0.03%、0.04%、0.05%的菌落数较少，成膜均匀，保鲜效果较优，表明Nisin有一定的抑菌作用，在一定的范围内，随着添加量的增加，抑菌效果增强。因此选取Nisin添加量为0.04%作为其他因素的单因素试验。

2.1.4 氯化钙添加量对干豆腐保鲜效果的影响

氯化钙添加量对干豆腐保鲜效果的影响如表6所示。

表6 氯化钙添加量对干豆腐保鲜效果的影响Table 6 The effect of calcium chloride addition on the preservation effect of dried bean curd

可食性涂膜中通过添加氯化钙能够显著的降低干豆腐中的菌落总数，氯化钙的添加量为0.2%时干豆腐的保鲜期为3 d，随着氯化钙浓度的增加，干豆腐的保鲜期逐渐延长，当添加量达到1.0%时保鲜时间出现下降趋势，同时随着添加量逐渐增多，干豆腐的涂膜逐渐增厚，影响感官评分和口感，因此选取0.8%的氯化钙浓度进行后续试验操作。

2.2 壳聚糖可食性涂膜溶液配制的正交试验设计

正交试验设计及结果如表7所示，菌落总数和感官评价方差分析如表8、表9所示。

表7 正交试验结果Table 7 Results of orthogonal test

表8 菌落总数方差分析表Table 8 Variance analysis table of colony totals

表9 感官评价方差分析表Table 9 Sensory evaluation variance analysis table

通过极差比较分析法和方差分析法，以及对不同因素的k和R进行比较分析，各因素对菌落总数影响的主次顺序是：柠檬酸（B）＞壳聚糖（A）＞Nisin（C）＞氯化钙（D），由表8可知各因素对试验结果的影响不显著，且干豆腐中菌落总数越少复合涂膜的效果越好，因此根据水平均值（K）可以得出各项指标的最佳水平组为：A1B3C2D2，由表7可知：各因素对感官评价影响的主次顺序是：壳聚糖（A）＞柠檬酸（B）＞Nisin（C）＞氯化钙（D），由表9可知各因素对试验结果的影响不显著，根据水平均值（K）可以得出各项指标的最佳水平组为：A1B3C2D1。

氯化钙在食品添加剂中作为一种凝固剂和增稠剂，防腐效果不及其他三因素，由于菌落总数是评价复合涂膜效果最重要的指标，同时考虑到食品添加剂的使用量标准，对于感官指标来说D因素影响较弱，所以选择D1或D2均可；而对于菌落总数指标来说，菌落总数越少保鲜效果越好，因此，宜选D2，所以综合考虑，应以A1B3C2D2为优化复合配方。

2.3 验证试验

正交试验所得的最佳组合为A1B3C2D2。因结果不在正交试验组合中，所以对干豆腐涂膜进行验证性试验，根据A1B3C2D2配制添加量为1.6%的壳聚糖、1.5%的柠檬酸、0.04%的Nisin、0.8%的氯化钙、1.0%甘油的混合涂膜液，在常温条件下贮藏，进行干豆腐保鲜试验。结果：4天后干豆腐的菌落总数为3.5×103CFU/g，低于正交设计表每个组合条件下干豆腐的菌落总数，并且感官评分为80，高于正交表中每个试验组的感官评分，保鲜效果显著。并且保鲜后的干豆腐色泽均匀一致，呈淡黄色，片薄形状完好，豆香味浓郁等，卫生指标符合国家标准GB 2711-2003《非酵性豆制品及面筋卫生标准》[16]。

3 结论

干豆腐的腐败是由细菌和真菌的共同作用造成的，使用可食性壳聚糖复合涂膜能有效抑制微生物的繁殖。本试验以干豆腐为保鲜对象，探究了可食性壳聚糖复合涂膜的不同添加量对干豆腐品质的影响，实验结果表明最佳涂膜保鲜配方和工艺为：壳聚糖1.6%、柠檬酸1.5%、Nisin 0.04%、氯化钙0.8%、甘油1.0%，在80℃下涂膜2 min，并对涂膜处理的干豆腐进行保鲜密封包装。在常温条件下，与对照组（CK）相比普通包装货架期能延长4 d。

壳聚糖的复合涂膜在很多领域中都得到了充分的利用，在生物领域中，因其具有良好的凝血特性、抗菌性和细胞相容性[17]，而被用来作为伤口敷料。在食品保鲜中，Ahmad M等[18]制备了30%的甘油作为增塑剂的胶原/壳聚糖和胶原蛋白/大豆蛋白分离物这两种不同混合比的复合膜，应用于食品包装。谢玉花等[19]使用不同浓度壳聚糖涂膜对贡柑贮藏品质进行研究，结果表明1%的壳聚糖涂膜处理后能有效提高感官评分、延缓失重率、促使VC等指标含量的下降，达到保鲜的目的。曹琳等[20]探究壳聚糖涂膜结合不同包装方式对鲜拨大蒜品质的影响，发现1.5%的壳聚糖涂膜加入保鲜剂后进行真空包装的保鲜效果最显著，可以延缓营养成分的丢失。总之，壳聚糖作为一种新型高分子涂膜保鲜剂，具有来源广泛，抗菌性强等优点，在食品保鲜领域具有广阔的发展前景。