DUSP10与SMAD7基因多态性与结直肠癌遗传易感性研究

段降龙，张 敏，刘思达，张金平，龙延滨，侯 峰，王朋园

(1. 陕西省人民医院普通外科，陕西西安 712000；2. 榆林市第一医院普通外科，陕西榆林 718000；3. 西藏民族大学，陕西咸阳 712082；4. 延安大学，陕西延安 716000；5. 西安医学院，陕西西安 712000)

结直肠癌亦称之为大肠癌，在我国各种恶性肿瘤发病率中居第3位。在长期的进化演进中，由于生存环境的差异,亚洲人种与欧美人种的遗传背景上明显不同，部分报道的易感性基因并不适用于亚洲人种[1]。这种差异性在人群中主要表现为单核苷酸多态性(SNP)，即在基因组DNA序列中，单个碱基的改变而导致的多态性。DUSP10(双特异性蛋白磷酸酶)属于DUSP家族的，作为一种负性调控原件，调控MAPK信号通路，与人类多种疾病密切相关。有研究表明，过表达的DUSP10可抑制直肠癌组织细胞的增殖能力[2]。PNG等[3]的研究表明，小鼠在敲除DUSP10基因后，加速了肠上皮细胞的增殖，从而使结直肠肿瘤的发生概率明显增高。DUAN等[4]研究报道，携带“G”等位基因者结直肠癌的发病风险降低。ZHANG等[5]发现rs908858位点增加结直肠癌的发病风险。SMAD7基因作为抑制因子,可以负调节TGF-β信号通路，该通路中任何组分的失活都会诱导细胞发生癌变。相关研究表明，G-C的单核苷酸多态性，存在于转录因子结合区的一个基因片段，长度大概为44 703 563 bp，而这种多态性能够增加SMAD7蛋白的表达，因此被认为是结直肠癌的一种易感因素[6]。JIANG等[7]的研究显示，等位基因T可以降低结直肠癌的患病风险。本研究将重点讨论DUSP10和SMAD7基因多态性与结直肠癌易感性之间的关系，为结直肠癌的诊治开拓一些新的方法和思路。

1 材料与方法

1.1研究对象及一般资料收集研究对象为2013-2015年间，由陕西省人民医院普外科和体检中心纳入符合研究标准的结直肠癌患者(结直肠癌组)及正常人群作为体健对照组(对照组)。共采集了临床确诊结直肠癌患者276例及体健对照者385例，共661例外周血液样本。病例组和对照组无年龄、性别的限制；采用统一的流行病学调查问卷，收集结直肠癌组和体健对照组的一般临床资料，包含性别、年龄、饮酒、吸烟、恶性肿瘤家族史等。吸烟者定义为吸烟累计多于100支者；饮酒史定义为至少饮酒1次/周、累计时间超过1年者；肿瘤家族史为一级亲属和/或二级亲属患有癌症者。

1.2样本采集

1.2.1 血液样本、DNA提取 室温解冻血液后转入到离心管(50 mL)中，如果血液凝固，则先用清洁的匀浆机搅拌均匀，依照DNA纯化试剂盒说明提取DNA。将提取到的DNA溶液转移到离心管(1.5 mL)中，于-20 ℃分装保存备用。

1.2.2 实验步骤 将定制的引物依照规划，混合、溶解及稀释每个反应内位点,抽取部分样本和阳性、阴性质控进行实验，从而对引物质量进行检验，并对实验条件进行优化。具体按以下步骤进行：①进行PCR扩增实验；②进行SAP纯化反应；③进行单碱基延伸；④进行树脂纯化；⑤上机进行点样；⑥进行质谱分析；⑦初步分析分型结果。

1.3统计学处理在数据分析时应用了哈迪-温伯格平衡检验(HWE)，若P<0.05，则说明满足HWE平衡。在研究基因单个SNP位点时，使用了单位点分析方法，本研究中P值使用双尾概率，以P<0.05为差异有统计学意义。并且应用了连锁不平衡(LD)分析，参照Gabriel等的方法构建单体型blocks，还有单体型(haplotype)分析，SHEsis软件用于基因上位点之间的连锁程度的分析，以及结直肠癌的发病风险与单体型之间的关联。

2 结 果

2.1研究对象临床资料的比较本研究包括276例结直肠癌病例和385例健康者，一般资料见表1。Pearson’sχ2分析表明性别因素在对照组和病例组间差异有统计学意义，女性少于男性，可能因为女性暴露于危险因素的概率少于男性，又可能与男女之间的激素水平差异相关。Welch’sTtest分析表明，在对照组与病例组之间，年龄的均值差异有统计学意义，年龄偏大的患者较多，可能是由于老年人机体功能下降、发病后不重视、体检频率较低等原因[8]。结直肠癌组的组织分型[n(%)]：结肠型154(55.8)，直肠型106(38.4)，其他16(5.8)。

表1结直肠癌组和体健对照组基本信息的比较

Tab.1 Basic information of colorectal cancer group and control group

临床特征结直肠癌(n=276)体健对照组(n=385)P性别[n(%)]0.007 男性171(62.0)197(51.2) 女性105(38.0)188(48.8)年龄 (x±s,岁)58.20±11.6250.67±8.430.000 <50岁(n)58191 ≥50岁(n)218194

2.2SNP分型及数据分析结果

2.2.1 卡方分析结果 表2显示了12个SNP 的基本信息。对照组12个位点均与哈迪-温伯格平衡定律(P-HWE>0.05)相符；在等位基因模型下，分析获得降低患结直肠癌风险的位点有DUSP10rs908858(OR=0.697，95%CI，0.559～0.871，P=0.001)、SMAD7rs12956924 (OR=0.714，95%CI，0.553～0.923，P=0.010)；分析获得增加患结直肠癌风险的位点有SMAD7rs11874392 (OR=1.389，95%CI，1.114～1.732，P=0.003)。

表2候选基因位点的基本信息

Tab.2 Basic information of candidate SNPs in this study

SNP ID基因等位基因(Aa/B)MAF结直肠癌组 对照组 HWE PORs 95% CI等位基因Prs908858DUSP10G/A0.4170.5070.3050.6970.559～0.8710.001∗rs12041033DUSP10G/C0.0720.0710.4191.0280.670～1.5760.901rs17010629DUSP10C/T0.2790.2940.8060.9320.731～1.1890.573rs12724393DUSP10G/C0.1240.1440.3000.8410.607～1.1650.298rs12036163DUSP10G/A0.0490.0630.6510.7690.474～1.2490.288rs11118838DUSP10C/A0.2610.2981.0000.8310.649～1.0640.142rs12044821DUSP10T/C0.0500.0640.6600.7640.471～1.2390.274rs6604668DUSP10C/T0.3850.4050.9150.9210.733～1.1580.482rs6689705DUSP10T/A0.2120.2430.2650.8400.645～1.0940.195rs12956924SMAD7A/G0.2340.2990.0840.7140.553～0.9230.010∗rs11874392SMAD7A/T0.4870.4060.5971.3891.114～1.7320.003∗rs1873190SMAD7T/C0.4440.4411.0001.0160.813～1.2700.890

Aa/B：对照组中的最小等位基因/参考等位基因；*P<0.05。

2.2.2 逻辑回归分析结果 以最常见的对照组纯合基因型作为参考(OR=1)，OR值和95%CI通过逻辑回归模型计算获得，经性别和年龄修正后发现，在最佳模型-加性模型下，DUSP10rs908858能使结直肠癌的发病风险减低(OR=0.70，95%CI，0.55～0.90，P=0.0047，表3)。

SMAD7rs11874392在最佳模型-加性模型下能增加结直肠癌的发病风险(OR=1.33，95%CI，1.05～1.68，P=0.017，表4)。

表3rs908858位点与结直肠癌风险的相关性

Tab.3 Relationship between rs908858 and the risk of CRC

Model基因型对照组结直肠癌组OR (95% CI)PAICBICCodominantA/A87911A/G2011350.69(0.46～1.02)G/G92460.50(0.30～0.82)0.0180797.8820.2DominantA/A87911A/G-G/G2931810.63(0.43～0.91)0.0140797.8815.7RecessiveA/A-A/G2882261G/G92460.64(0.42～0.97)0.0350799.4817.3OverdominantA/A-G/G1791371A/G2011350.92(0.66～1.29)0.6300803.6821.5Log-additive---0.70(0.55～0.90)0.0047∗795.9813.8

ORs(95%CI)代表风险比和95%的可信区间；*P<0.05。

2.2.3 连锁不平衡与单体型的构建DUSP10基因上的9个SNP位点分别构成了2个单体域(Block)，而单体域的构建是根据其连锁不平衡的系数(图1)。Block1中包括rs12041033、rs17010629、rs12724393、rs12036163和rs11118838；Block2中包括rs12044821、rs6604668和rs6689705。在校正了年龄和性别后，逻辑回归分析显示DUSP10基因中的单体型“GTCAA”增加结直肠癌的患病风险程度高于野生型单体型(adjustedOR=10.52，95%CI：2.41～45.93，P=0.0018，表5)。

3 讨 论

对结直肠癌的易感基因的研究有助于对高危人群的确定，更加及时了解结直肠癌的患病风险，进而有指向性地改进自己的生活方式及改变生活环境，达到避免疾病发生或推迟疾病发生的目的。

表4rs11874392位点与结直肠癌风险的相关性

Tab.4 Relationship between rs11874392 and the risk of CRC

Model基因型对照组结直肠癌组OR (95% CI)PAICBICCodominantT/T138771T/A1801291.30(0.89～1.91)A/A66701.77(1.11～2.85)0.057809.7832.1DominantT/T138771T/A-A/A2461991.43(1.00～2.05)0.051809.6827.6RecessiveT/T-T/A3182061A/A66701.51(1.00～2.28)0.048809.5827.5OverdominantT/T-A/A2041471T/A1801291.04(0.74～1.45)0.820813.3831.3Log-additive---1.33(1.05～1.68)0.017∗807.7825.7

ORs (95%CI) ：风险比和95%的可信区间；*P<0.05。

表5DUSP10基因的单倍型与结直肠癌发病风险的关系

Tab.5DUSP10 haplotype and its association with the risk of CRC

rs12041033rs17010629rs12724393rs12036163rs11118838OR (95% CI)PCTCAA1-CCCAC1.01(0.72～1.43)0.93CCGAC0.77(0.52～1.13)0.18GTCGA0.74(0.45～1.23)0.25GTCAA10.52(2.41～45.93)0.0018∗

ORs(95%CI)：风险比和95%的可信区间；*P<0.05。

图1DUSP10基因上的9个SNP位点连锁不平衡图

Fig.1 Linkage disequilibrium map for SNPs in theDUSP10 gene

本研究显示，结直肠癌患者的性别和年龄的分布存在统计学差异。女性患者少于男性患者，可能因为女性暴露于危险因素的概率少于男性，也可能与男女体内激素水平的不同有关。老年患者多于年轻患者，可能是由于老年人机体功能下降、发病后不重视、体检频率较低等原因，这与相关方面的研究一致[8]。本研究对12个SNP位点成功地进行了分型，统计分析结果表明，DUSP10rs908858(OR=0.70，95%CI，0.55～0.90，P=0.004 7)、SMAD7rs12956924和rs11874392(OR=1.33，95%CI，1.05～1.68，P=0.017)，与结直肠癌的发病风险显著相关。DUSP10(双特异性蛋白磷酸酶)属于DUSP家族。DUSP家族灭活靶标激酶活性的时候，是通过去磷酸化磷酸丝氨酸/苏氨酸和磷酸酪氨酸残基的方式，作为一种负性调控原件，调控MAPK信号通路，与人类多种疾病密切相关。有研究表明，过表达的DUSP10可抑制直肠癌组织细胞的增殖能力[2]。PNG等[3]的研究表明，小鼠在敲除DUSP10基因后，因加速了肠上皮细胞的增殖，从而使得结直肠肿瘤的发生概率明显增高。本研究发现，位于DUSP10基因的等位基因rs908858“G”可降低结直肠癌的发病危险度，而DUSP10基因中的单体型“GTCAA”增加结直肠癌的患病风险。DUAN等[4]在其研究中报告携带“G”等位基因者结直肠癌的发病风险降低，这与本研究结果很相近。相反，ZHANG等[5]发现rs908858位点增加结直肠癌的发病风险。关于该位点研究结果的不同，可能是样本量不足引起的，亦或是由于多种遗传的背景导致的。SMAD7基因为一种抑制因子,能够对TGF-β信号通路进行抑制，该通路中任何组分的失活都会诱导细胞发生癌变。有研究表明，G-C的单核苷酸多态性，存在于转录因子结合区的一个基因片段，它的长度大概为44 703 563 bp，而这种多态性，能够增加SMAD7蛋白的表达，故而被看作为结直肠癌的一种易感因素[6]。rs11874392位于SMAD7基因的一个内含子中，本研究发现，其突变型(小)等位基因A与直肠癌的发病具有相关性，根据JIANG等[7]的研究结果，野生型等位基因T为一种保护因素，本研究结果与其一致。JIANG等[7]的研究中显示，等位基因T可以降低结直肠癌的患病风险。我们得到的数据中，T基因频率为59.4%，这是一种野生型等位基因；JIANG等的结果显示T为一种小等位基因，频率为49%，我们得到的基因频率比其高出10.4%。本研究还分析了5种遗传模型，结果表明，rs11874392在加性模型下可使结直肠癌患病危险度升高。

本研究发现DUSP10、SMAD7基因与结直肠癌的发病风险有很大的关联，而且相对于野生型单体型，“GTCAA”明显增加结直肠癌的患病风险。但是，DUSP10与SMAD7基因之间是否有相互影响而使结直肠癌的患病风险有所改变，本研究还尚未涉及，因而后续将继续扩大样本，进一步探究DUSP10与SMAD7基因之间的关系及对结直肠癌的影响。