COL9A1基因多态性与大骨节病膝关节软骨中COL9A1表达的关系

孙正明，董向辉，常彦海，吴学元，靳占奎，易 智，凌 鸣，郭 雄

(1. 陕西省人民医院骨科，陕西西安 710068；2. 西安交通大学医学部，陕西西安 710061)

大骨节病(Kashin-Beck disease, KBD)是一种地方性的慢性关节疾病，病理表现为软骨生长板深层软骨细胞和关节软骨坏死[1]，临床表现为关节变形膨大、功能受损甚至致残，严重影响患者的生活质量[2]。

KBD的病因至今不明确，研究认为KBD是由环境因素和基因/易感基因相互作用所导致的复杂性疾病[3-4]。COL9A1在退行性骨关节疾患中有重要作用[5-6]。在一些骨关节疾病动物模型中，COL9A1基因表达明显增高[7]，研究证实，COL9A1基因多态性(rs6910140)C等位基因与成人及儿童KBD患者易感性降低相关[8-9]。但COL9A1基因多态性(rs679620)与KBD患者关节软骨COL9A1表达水平间的关系尚未见报道。本研究拟对rs6910140基因多态性与KBD患者膝关节软骨中COL9A1表达进行相关分析，为进一步研究COL9A1在KBD发病中的作用提供新思路。

1 材料与方法

1.1研究对象选择2013年7月至2017年1月在陕西省人民医院骨科行膝关节置换37例，膝关节镜清理术的KBD患者28例，共65例，年龄33～68岁，平均(57.3±1.7)岁。都为无血缘关系的北方汉族，按照我国《大骨节病诊断》(WS/T 207-2010)标准进行KBD诊断。空腹抽取患者外周静脉血2～3 mL，用于1.2中基因多态性分析；膝关节置换患者均取其股骨或胫骨关节面软骨，膝关节镜手术患者取其关节软骨剥脱处的软骨，用于免疫组化实验。

1.2基因多态性分析DNA提取盒(广州东盛生物科技有限公司)提取全基因组DNA，并检测样本DNA的纯度和浓度(NanoDrop ND-100，美国)。基因型借助基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行分析。PCR引物和单碱基延伸引物用Assay Designer(Sequenom)软件包设计。基因多态性分型是由基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF)的MassARRAY系统(Sequenom，美国)完成；结果由MassARRAY RT软件系统(版本号3.0.0.4)实时读取，且由MassARRAY Typer软件系统(版本号3.4)完成SNP分型。

1.3关节软骨的免疫组化软骨样本经100 mL/L甲醛固定，常规包埋并制成蜡块，连续切取5 μm厚切片，SP法染色检测。切片脱蜡水化，30 mL/L过氧化氢清除内源性过氧化物酶活性，修复抗原，血清封闭，滴加一抗(稀释比为1∶50)、二抗后经链霉素亲生物素-过氧化物酶溶液染色，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封固。

结果评定：对每张切片的阳性细胞着色强度和阳性细胞数分别记分；细胞核蓝色者为阴性，细胞核有棕黄色颗粒者为阳性。阳性细胞率为阳性细胞占计数细胞的百分比，每张切片随机取10个400倍视野进行分析。阴性记0分，弱阳性记1分，阳性记2分，强阳性记3分；总积分=各积分(染色强度×染色阳性细胞率)之和/10。

1.4统计学处理用SPSS 18.0统计软件包分析。研究对象的特征用非参数卡方检验，方差分析各基因型与软骨COL9A1表达之间的关联，全部检验都为双尾检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1研究对象的临床资料特征COL9A1 TT基因型者46例，COL9A1 CT基因型者14例，COL9A1 CC基因型者5例。3种基因型患者在年龄、性别、膝关节分级和手术方式均匹配(表1)。

表1研究对象的临床特征

Tab.1 Characteristics of the studied subjects

临床特征COL9A1基因型[n(%)]TTCTCCχ2P性别 男19(41.3)10(71.4)3(60.0) 女27(58.7)4(28.6)2(40.0)4.0850.130年龄(岁) ≥5030(65.2)9(64.3)4(80.0) <5016(34.8)5(35.7)1(20.0)0.4610.694K-L分级 Ⅳ级28(60.9)5 (35.7)2(40.0) Ⅲ级10(21.7)7(50.0) - Ⅱ级8(17.4)2(14.3)3(60.0)3.0610.216手术类型 膝关节置换28(60.9)8(57.1)1(20.0) 关节镜清理18(39.1)6(42.9) 4(80.0)3.0250.220

2.23种基因型患者膝关节软骨COL9A1的表达情况与TT基因型携带者相比，CC基因型携带者膝关节软骨COL9A1的表达差异有统计学意义(P<0.05)；同时，TT基因型携带者与CT基因型携带者，以及CT基因型携带者和CC基因型携带者膝关节软骨COL9A1的表达差异无统计学意义(P>0.05，表2)。

表2COL9A1在不同基因型KBD患者膝关节软骨中的表达

Tab.2 The expression of COL9A1 in the articular cartilage of KBD patients of different gene types

COL9A1基因型n总积分P TT4649.83±0.64CT1451.93±1.010.055CC552.89±1.030.049

CT基因型和CC基因型比较，P=0.558。

根据X线分级分析示，总的样本和TT基因型携带者中COL9A1在软骨中的表达与KBD膝关节炎的严重程度呈反比，且Ⅱ级COL9A1的表达显著高于Ⅳ级(P<0.05，表3、表4)。

表3全部样本不同病变软骨中COL9A1的表达

Tab.3 The expression level of COL9A1 in the cartilage of different lesion grades

X线分级n总积分PⅡ级3551.74±0.60Ⅲ级1749.88±0.810.493Ⅳ级1347.85±1.840.010

Ⅲ级样本和Ⅳ级样本比较，P=0.342。

表4COL9A1TT基因型患者中不同病变软骨中COL9A1的表达

Tab.4 The expression level of COL9A1 in the cartilage of different lesion grades of TT genotype

X线分级n总积分PⅡ级852.07±0.71Ⅲ级1050.50±1.150.081Ⅳ级2846.13±1.900.002

Ⅲ级样本和Ⅳ级样本比较，P=0.888。

3 讨 论

KBD的发病原因仍不清楚，研究证实，遗传因素在个体发病导致KBD易感性方面可能有特殊作用[10]。COL9在软骨及骨关节退变方面发挥着重要作用，且COL9A1基因多态性与KBD相关[8-9]；但COL9A1(rs6910140)基因多态性与KBD患者关节软骨COL9A1表达的关系尚未见报道。本研究从基因和组织学角度研究COL9A1在KBD膝关节炎发病中的作用，结果证实，COL9A1基因多态性与KBD患者膝关节软骨中COL9A1表达具有相关性，且携带TT基因型的个体，随着X线分级的提高，其软骨中COL9A1的表达积分也降低。

Ⅸ胶原蛋白由3个a链组成的异三聚体结构，即a1(IX)、a2(IX)、a3(IX)，其中a1(Ⅸ)由基因COL9-A1编码，通过共价交联结构粘附在Ⅱ型胶原纤维表面发挥相应的功能[11]。Ⅸ胶原基因突变导致的骨骼改变提示蛋白分子与关节软骨的寿命及骨软骨病密切相关[12-13]，且COL9A1在退行性骨关节疾患中有重要作用[5-6]。rs6910140基因多态性位于COL9A1基因片段，研究提示，携带CC基因型个体的KBD患病风险为携带TT个体的0.49倍，即携带CC基因型个体的KBD患病风险更低，且CC基因型携带者KBD的关节病变更轻。研究者认为，COL9A1基因的rs6910140多态性在a1(IX)表达中重要的决定性作用，并且通过改变a1(IX)表达而影响软骨的退变及破坏，从而影响KBD[8]。本研究结果提示，rs6910140基因多态性中3种不同基因型携带者的膝关节软骨表达COL9A1的积分不同，差异有统计学意义(P<0.05)，CC基因型最高，CT基因型次之，TT基因型最低，说明COL9A1的rs6910140基因多态性与KBD相关。

通过对研究对象X线分级分层分析，结果显示，随着病变的加重，软骨COL9A1的表达减弱，与Ⅳ级相比，Ⅱ级软骨中COL9A1的表达显著增高，且差异有统计学意义(P<0.05)。对TT基因型携带者进行的X线分级分层分析结果也显示，软骨COL9A1的表达与病变级别呈反比，与Ⅳ级相比，Ⅱ级软骨中COL9A1的表达显著增高，且差异也有统计学意义(P<0.05)。因样本量不大，无法对CC和CT基因型携带者进行X线分级分层研究。

综上所述，本研究表明，COL9A1基因多态性(rs679620)与KBD患者膝关节软骨COL9A1表达具有相关性，但COL9A1表达与KBD的严重程度负相关，结果需更大样本量来检验。