颐脑解郁复方对卒中后应激大鼠肠道菌群的影响＊

刘海鹏，李小黎＊＊，田会玲，孙新月，林亮吟，陈弘婧，张淑静

（1.北京中医药大学第三附属医院 北京 100029；2.北京中医药大学中医学院 北京 100029）

卒中后抑郁（Post-stroke Depression，PSD）是临床脑卒中后常见并发症。大样本临床研究显示，PSD对脑卒中患者神经功能康复、生活质量和生存率有重要影响，明显加重患者、家庭及社会的经济负担，目前受到越来越多的重视[1]。本课题组以往的研究结果表明，颐脑解郁复方对PSD大鼠抑郁症状具有明显改善作用[2]；另有研究表明，肠道菌群失调是神经精神障碍疾病发病的关键因素之一，肠道内微生物群落的种类、组成和数量的平衡与焦虑、抑郁等疾病相关[3][4]。本研究拟从卒中后应激大鼠肠道菌群的改变探讨颐脑解郁复方对PSD的干预机制。

1 实验材料

1.1 实验动物及实验环境

实验动物由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号为SCXK（京）2012-0001，饲养于北京中医药大学动物实验室，室温（20±2）℃、相对湿度50%-60%，光照明暗交替12 h/12 h，自由摄食饮水。

1.2 药物及制备

颐脑解郁复方由北京中医药大学第三附属医院提供；对照药物为盐酸氟西汀胶囊，由礼来苏州制药有限公司提供，药品批号为：国药准字J20170022。

1.3 主要试剂与仪器

Nanodrop（美国Thermo Scientific公司，型号NC2000），PCR扩增仪（美国ABI公司，型号2720），酶标仪（美国BioTek公司，型号FLX800T），电泳仪（北京六一生物科技有限公司，型号DYY-6C），凝胶成像系统（北京百晶生物技术有限公司，型号BG-gdsAUTO(130)），Agarose（美国 Invitrogen公司，货号 75510-019），Q5® High-Fidelity DNA Polymerase（美国 NEB公司，货号 M0491L），Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit（美国Invitrogen公司，货号P7589），Marker（日本Takara公司，货号DL15000或DL2000），TAE（美国Invitrogen公司，货号AM9870），戊巴比妥钠（美国Sigma公司，货号P3761-5），栓线（北京西浓科技有限公司，货号2838-A4），旷场试验用敞箱（自制），强迫游泳试验用水箱（自制）。

2 实验方法

2.1 分组及给药

健康SD雄性大鼠48只，清洁级，300±20g，适应性喂养1周。1周后根据体重随机分组，分为假手术组、卒中后应激组、西药组和中药组，每组各12只。假手术组只分离血管不插入线栓，卒中后应激组、西药组和中药组均在大脑中动脉阻塞术（middle cerebral artery occlusion，MCAO）后7天进行卒中后应激模型制备。根据大鼠体重计算氟西汀胶囊、颐脑解郁复方药液每日灌胃量，自应激开始至实验结束。中药组每日灌胃1次，根据此前研究[2]确定灌胃剂量为9.92 g/（kg·d）；西药组每日予氟西汀溶液每日等容积混悬液灌胃1次，按照成人用量7倍计算大鼠用量为2.33 mg/（kg·d）；余下各组均每日给于蒸馏水10 ml·kg-1灌胃1次。

2.2 模型制备

2.2.1 卒中模型的制备

采用MCAO所致的局灶性脑缺血模型。大鼠麻醉后，按照Bederson等的方法，将尼龙线栓从颈内动脉小口轻轻插入至Willie's环大脑前动脉起始处；假手术组只游离血管不插线。结扎、缝合。2 h后将脑卒中模型大鼠尼龙线轻柔拔出1 cm左右，剪掉暴露于皮肤外的栓线。脑卒中模型大鼠入选的标准（按照ZeaLonga5级评分法取评分为1、2、3分的大鼠）：大鼠于缺血2h后出现脑缺血对侧前肢倦曲或行走转圈或行走向对侧倒体征则纳入，大鼠无此体征或于2 h后仍不清醒者弃去。

2.2.2 卒中后应激大鼠模型的制备

制备局灶性脑缺血复合孤养、束缚应激的卒中后应激大鼠大鼠模型。缺血性脑卒中模型制备成功后，待术后7 d大鼠神经功能缺损症状稍恢复后，即将卒中后应激大鼠组、西药组和中药组大鼠固定在特制的T型束缚台上（自制），连续7 d，每天于10:00-16:00期间任取时间，予以2 h的行为限制，并予以单笼饲养直至实验结束。

2.3 行为学观察

2.3.1 蔗糖水试验

实验第14 d末，各组进行蔗糖水试验。试验前，先给予20小时的禁食禁水，然后同时给予每只大鼠事先定量好的两瓶水：一瓶l%蔗糖水，一瓶普通饮用水。30分钟后调换蔗糖水和纯水的位置，60分钟后取走两瓶并称量。计算大鼠糖水消耗比例（蔗糖水偏爱）=糖水消耗量/总液体消耗量。

2.3.2 旷场试验

实验第14 d末，进行旷场试验。将大鼠置于场箱中心方格内，观察大鼠在3分钟内穿越格数（为水平运动得分，四爪均进入方格时方可记数一次）、后肢直立次数（为垂直运动得分，两前爪腾空或攀附墙壁时记数一次）。

2.3.3 强迫游泳试验

实验第14 d末，进行强迫游泳试验。在大鼠禁食2l h后进行。水深25 cm，水温25±1℃，大鼠在水中不能以后爪支撑身体，也不能以前爪攀附于缸壁，连续观察5 min，累计大鼠在水中游泳时间和停止挣扎、呈漂浮状态的时间。每只大鼠仅进行一次实验。

2.4 肠道菌群种类及丰度的差异研究

所有大鼠分别在实验第14 d末，行为学测试前，在超净工作台，通过揉腹等方法促使大鼠排便，每只大鼠至少取两粒粪便，每粒粪便置于无菌冻存管中，保存于-80℃环境中。使用宏基因组DNA提取试剂盒提取粪便中的总DNA；以细菌16SrDNA基因的V3-V4可变区序列为靶标，以带有barcode序列的338F-806R为引物，进行PCR扩增，获取PCR产物；PCR产物经过定量及文库构建后，利用IlluminaMiSeqPE300平台进行高通量测序，获取细菌16SrDNA基因的V3-V4可变区碱基序列信息；利用QIIME软件，对测序片段进行OTU（分类学操作单元）聚类，OUT代表序列与silva数据库进行比对分析，获取OUT对应的分类单元（包括门纲目科属种）及其相应的丰度。聚类后的目标序列按照97%的相似度计算数量，同时采用众数原则对每一个操作分类单元进行物种注释，对各样本（组）在不同分类水平的具体组成进行分析（并检验组间是否具有统计学差异）。

表1 各组大鼠行为学变化结果（s，n=6）

表1 各组大鼠行为学变化结果（s，n=6）

注：与假手术组比较，▲P ＜ 0.05，▲▲P ＜ 0.01；与PSD组比较，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01。

游泳挣扎时间/s（强迫游泳试验）277.17±4.62 251.33±10.57▲▲257.17±20.49▲266.83±2.92*9.92 0.00组别假手术组卒中后应激组西药组中药组F值P值蔗糖水偏好度（蔗糖水试验）0.80±0.04 0.66±0.05▲▲0.74±0.07 0.72±0.11 3.81 0.03旷场水平得分65.00±7.40 48.17±7.93▲▲61.83±15.42*61.67±5.12*10.63 0.02旷场垂直得分15.00±2.44 11.17±2.31▲▲13.17±1.47 13.33±1.96 3.40 0.04

图1 菌群分类学组成和分布图

3 数据处理与统计学分析

应用SPSS 20.0软件进行统计学分析，实验数据以平均数±标准差表示，方差齐，多组间比较采用单因素方差分析，方差不齐用Welch法分析，两两比较用LSD法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

4 实验结果

4.1 蔗糖水试验结果

卒中后应激组大鼠与假手术组相比较，其蔗糖水偏好度显著下降，差异具有统计学意义（P＜0.01）；西药组与卒中后应激组，中药组与卒中后应激组，中药组与西药组之间的对比差异均无统计学意义（P＞0.05）。结果见表1。

4.2 旷场试验结果

卒中后应激组大鼠与假手术组相比较，其水平得分和垂直得分均显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.01，P＜0.01）；卒中后应激组与西药组和中药组相比较，水平得分均显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.05）；卒中后应激组与西药组和中药组相比较，垂直得分降低，但差异不具有统计学意义（P＞0.05，P＞0.05）；中药组与西药组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

4.3 强迫游泳试验结果

卒中后应激组与假手术组和中药组相比较，游泳挣扎时间减少，差异具有统计学意义（P＞0.01，P＞0.05）；西药组与假手术组相比较，游泳挣扎时间减少，差异具有统计学意义（P＞0.01）；卒中后应激组与西药组相比较，游泳挣扎时间减少，但差异不具有统计学意义（P ＞ 0.05）（表1）。

4.4 菌群分类学组成的分布特征及菌群变化

在“属”水平上，菌群分类学组成和分布的结果显示，各组大鼠肠道菌群中具有明确分类的菌属共68种，其中Lactobacillus、Bacteroides、Blautia等18种菌属在数量上占绝对优势，占97.2%，其他50种劣势菌属因其含量过少，合记为Others（见图）。①与假手术组相比，卒中后应激组中Allobaculum、Sutterella、Dorea和rc4-4比例显著下降（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05）；Oscillospira比例显著上升（P ＜0.01）。②与卒中后应激组比较，中药组大鼠粪便中Lactobacillus、Bacteroides、Parabacteroides、Roseburia、Dorea和 rc4-4比例显著升高（均P＜0.01），Oscillospira比例显著降低（P ＜0.05），其中以Lactobacillus和Bacteroides差距最为明显，分别为27.91%vs5.96%和24.21%vs9.62%。③与西药组相比，中药组大鼠粪便中Bacteroides，rc4-4比例显著升高（P＜0.01，P＜0.05）（表2）。

表2 各组肠道菌群之间的比较检验结果（s,n=6）

表2 各组肠道菌群之间的比较检验结果（s,n=6）

注：与假手术组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与卒中后应激组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与西药组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

P值0.00 0.00 0.06 0.25 0.18 0.00 0.02 0.11 0.00 0.03 0.035 0.00 0.08 0.00 0.24 0.00 0.84 0.66组别菌属Lactobacillus Bacteroides Blautia Enterococcus Prevotella Allobaculum Oscillospira[Prevotella]Sutterella Roseburia Coprococcus Dorea Ruminococcus Parabacteroides Clostridium rc4-4 Phascolarctobacterium[Ruminococcus]假手术组2.56±2.44 10.68±5.51 15.03±7.14 0.02±0.03 6.04±3.47 29.55±7.77 2.35±1.05 18.64±17.77 7.80±4.39 0.26±0.28 0.45±0.22 1.75±1.29 0.67±0.22 0.41±0.16 0.50±0.38 0.95±0.61 0.45±0.80 0.45±0.48卒中后应激组5.56±3.41 9.62±2.88 12.21±12.39 35.75±39.70 8.75±8.87 1.45±1.33▲▲9.71±8.10▲▲4.42±4.26 0.40±0.31▲▲0.63±0.82 2.90±2.63▲0.22±0.06▲▲2.92±2.64 0.69±0.28 0.54±0.56 0.19±0.15▲1.07±1.37 1.07±1.37西药组25.56±18.89▲▲**11.67±7.31 18.31±19.43 0.03±0.04 9.52±9.51 3.49±2.87▲▲5.03±1.54 2.95±2.06 4.15±1.68▲*5.49±5.67 1.66±1.61 1.30±0.66**1.60±1.55 0.96±0.38▲▲1.64±1.44 0.69±0.42 0.86±1.40 0.85±0.81中药组27.91±14.40▲▲**24.21±5.23▲▲**##5.91±1.75 0.04±0.05 3.42±1.32 2.73±3.06▲▲3.42±1.86*8.01±5.41 1.30±1.07▲▲9.33±6.89▲▲**1.74±1.12 1.59±0.52**1.58±1.02 1.28±0.42▲▲**1.78±2.01 1.36±0.59**#1.04±1.54 1.04±0.89 F值9.92 9.37 8.78 10.33 9.17 9.89 10.39 9.78 8.92 8.91 8.66 8.46 2.58 7.93 10.03 6.30 0.29 0.54

5 讨论

近期流行病学研究显示，卒中后五年内，PSD的综合发生率为31%[5]。PSD的发生常伴有肠道功能障碍，出现体重减轻、腹泻、食欲差等症状，严重影响脑卒中后的恢复、加重抑郁症状[6]。本研究行为学结果显示，与假手术组相比较，卒中后应激组大鼠蔗糖水偏好度、旷场得分和游泳挣扎时间均显著降低，表明卒中后应激大鼠对美好事物的向往和陌生环境的好奇程度均明显下降，而在危险情况下的绝望程度增加，从而说明了卒中后应激大鼠处于应激状态。与卒中后应激组相比较，中药组大鼠水平得分和游泳挣扎时间显著升高，提示颐脑解郁复方在一定程度上改善了卒中后应激大鼠的应激症状。

PSD的发生与大脑关系密切，而肠脑轴（gut-brain axis）是胃肠道与大脑之间复杂的双向调控通路，其整合了胃肠道和大脑间的营养、内分泌、神经传导和免疫学信号传输[7-9]，肠道菌群是这条通路的重要参与者，因此也有研究称其为“微生物-肠-脑轴”[10-12]。肠道内的自然菌群,如乳酸菌、拟杆菌、双歧杆菌等，以相对恒定的比例长期定植在固定区域，通过自身代谢改变周围环境的成分,从而维持肠道菌群的动态平衡。本研究结果显示，与卒中后应激组相比，中药组大鼠粪便中Lactobacillus、Bacteroides、Parabacteroides、Roseburia、Dorea和rc4-4比例显著升高，Oscillospira比例显著降低，其中以乳杆菌属（Lactobacillus）和拟杆菌属（Bacteroides）比例提升最为明显；与西药组相比，中药组大鼠粪便中Bacteroides和rc4-4比例显著升高。研究表明[13]，乳酸菌可通过调节肠道免疫、促进神经信号物质产生、调节内分泌细胞激素等方面的作用来缓解和预防精神性疾病；肠道乳杆菌属减少、肠球菌等需氧菌异常增加参与抑郁的发生过程[14]，而益生菌治疗后，肠道菌群失调得到改善，患者的抑郁症状减轻[15]。另有研究发现，注射瑞士乳杆菌NS8可改善大鼠慢性束缚应激引起的行为、认知和生化异常，这种作用可能与微生物-肠-脑轴有关[16]。国外研究发现，拟杆菌对多糖的利用尤为突出，能帮助宿主高效的分解多糖，从而提高其营养利用率[17]。拟杆菌还在维持肠道菌群动态平衡[18,19]，提高宿主免疫力[20]，促进肠黏膜血管的生成和发育[21]等方面具有重要作用。由以上可知，乳杆菌属和拟杆菌属具有良好的益生作用，而乳杆菌属和拟杆菌属占据了中药组大鼠肠道菌群（已知种类）52.12%的含量，从而说明，颐脑解郁复方可通过增加乳杆菌属和拟杆菌属的含量促进肠道菌群动态平衡的恢复，进而改善大鼠的类似抑郁症状。此外，与西药组相比，中药组大鼠粪便中拟杆菌属（Bacteroides）含量明显升高，提示颐脑解郁复方对于肠道菌群动态平衡的恢复可能优于盐酸氟西汀胶囊。目前关于Oscillospira、Parabacteroides、Roseburia、Dorea、和rc4-4的研究尚不深入，有待进一步研究。

颐脑解郁方为本课题组前期治疗PSD的中药复方，含5味中药（君药-刺五加；臣药-五味子、郁金；佐药-栀子、川芎），具有益气舒肝，调气活血的作用。从中医角度来讲，PSD的中医病机为脾肾亏虚，气滞痰瘀，病位在肾、肝、脾三脏，而“肾司二便，肝主疏泄，肝与大肠相别同，脾主升清降浊”，肾、肝、脾三脏均可从不同角度调节肠道功能，因此颐脑解郁复方可以通过调节肾、肝、脾的功能间接起到调节肠道功能的作用，从而改善肠道菌群。从单味药现代研究来看，刺五加、五味子和栀子已经被证实具有调节动物肠道菌群的作用。研究发现，刺五加能有效升高犊牛消化道内双歧杆菌、乳酸杆菌的数量,促进犊牛肠道内有益菌菌群的生长和增殖[22]；刺五加提取物有助于升高断奶仔猪肠道内容物乳酸杆菌的数量,抑制大肠杆菌增殖,显著增加肠道微生物的多样性[23]；五味子能有效地调整肝硬化大鼠的肠道菌群，并降低其肝损伤，是一种理想的微生态调节剂[24]；栀子中、高剂量对大鼠肠道内肠杆菌具有一定的抑制作用，但不影响双歧杆菌和乳酸杆菌的数量，提示栀子没有导致大鼠肠道菌群失调，而是起到了改善其肠道菌群的作用[25]。虽然没有研究证实郁金和川芎具有调节肠道菌群的作用，但郁金和川芎都具有调节肝胆的作用，猜测其可能具有通过调节胆汁分泌间接影响肠道菌群的作用。综上所述，可以推测颐脑解郁复方通过增加了卒中后应激大鼠肠道中乳杆菌属（Lactobacillus）和拟杆菌属（Bacteroides）的数量，从而减轻了其抑郁症状，其相关机制尚待进一步深入研究。