胃癌患者血清Ⅺ型胶原α1链的表达及临床意义

纪润璧，顾红兵

（江苏大学附属人民医院检验科，江苏镇江212002）

目前已广泛应用于胃癌检测的血液肿瘤标志物如癌胚抗原（CEA）、癌抗原（CA）系列等，诊断的灵敏度相对较低。寻找有效的胃癌诊断分子标志物具有重要的临床意义。胶原是微环境中细胞外基质的重要成分之一，近年来研究提示Ⅺ型胶原的特异性裂解片段 α1链（collagen typeⅪ alpha 1 chain，COL11A1）可能在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用［1］。已有文献报道COL11A1参与调控胃癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭［2］。但COL11A1在胃癌患者血清中表达如何，是否可以作为新的肿瘤标志物应用于临床，目前国内外缺乏相关报道。本研究检测了胃癌患者血清中COL11A1基因的表达水平，分析了其与临床病理参数的关系，评估了其作为胃癌诊断新指标的潜能。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2017年1月至2018年3月江苏大学附属人民医院普外科就诊的胃癌患者50例，其中男36例，女14例，年龄46～84岁，平均年龄（68±8）岁。纳入标准：组织病理学确诊为胃癌；术前未行放化疗和其他抗肿瘤治疗；无严重其他系统疾患。排除标准：近6个月内使用激素类药物或免疫抑制剂者；合并严重心肝肾功能不全者；有手术禁忌证者。收集患者临床信息，包括年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移、浸润深度和TNM分期等。

选取同期年龄和性别匹配的健康体检者25例，男17例，女8例，年龄36～78岁，平均年龄（62±10）岁。经电子胃镜确诊的浅表性胃炎患者25例，男15例，女10例，年龄41～72岁，平均年龄（58±7）岁。样本采集经江苏大学附属人民医院伦理委员会批准，受试者均知情同意。

1.2 血清标本采集与处理

胃癌患者于术前1 d、健康体检者于体检时、浅表性胃炎患者于门诊就诊时采集2mL外周静脉血，常规离心（3 000 r／min）10 min，血清分装后 -80℃保存备用。

1.3 RNA提取与qRT-PCR检测COL11A1 mRNA的表达

TRIzol LS试剂（美国Therom公司）提取血清中总RNA，按逆转录试剂盒（中国Vazyme公司）说明书逆转录为cDNA。按照 UltraSYBR qRT-PCR Mixture试剂盒（中国Vazyme公司）说明书配置反应体系。qPCR总反应体系为20μL，包括上、下游引物（10μmol／L）各 0.4μL，SYBR Green Master Mix 10 μL，cDNA模板2μL，无RNA酶去离子水6.8μL和ROX 0.4μL。循环参数：95℃预变性5 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，78℃ 31 s，共 40个循环。选取 β-肌动蛋白作为内参基因，采用ABI 7300实时荧光定量PCR仪进行分析。COL11A1 mRNA的相对表达水平以 2-△△Ct法统计：△△Ct＝［（样本Ct目的基因-样本Ct管家基因）-（对照组 Ct目的基因-对照组 Ct管家基因）］。COL11A1上游引物序列为 5′-AGTGGCATCGGGTAGCAATCA-3′，下游引物序列为 5′-TGTCCCCCTCAAAAACTTCTTCAT-3′。β-肌动蛋白上游引物序列为 5′-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3′，下游引物序列为 5′-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3′。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 胃癌患者血清中COL11A1 mRNA的表达

COL11A1 mRNA在胃癌患者血清中的表达（5.196±1.417）较健康体检者（1.398±0.182）明显升高（t＝2.659，P＜0.05），而浅表性胃炎患者血清 COL11A1 mRNA表达（1.011±0.129）与健康体检者相比差异无统计学意义（t＝1.791，P＞0.05）。

2.2 COL11A1 mRNA表达与临床病理参数的相关性

统计分析结果显示，在非胃癌人群中（包括健康体检者和浅表性胃炎患者），血清COL11A1 mRNA表达与性别、年龄无明显关系（P＞0.05）。见表1。在胃癌组中，COL11A1 mRNA表达与肿瘤浸润深度、肿瘤TNM分期有关（P＜0.05），与患者性别、年龄、肿瘤最大径和淋巴结转移等无明显关系（P＞0.05）。见表2。

表1 非胃癌人群血清COL11A1表达与性别和年龄的关系

2.3 胃癌血清COL11A1的ROC曲线和诊断效能评价

以健康体检者和浅表性胃炎患者为对照组（50例），胃癌患者为疾病组（50例），绘制ROC曲线分析COL11A1的诊断价值。胃癌患者血清COL11A1的ROC曲线下面积为0.811，95%可信区间（CI）为0.680～0.942，当临界值为 1.583时，敏感性为75%，特异性为76.5%。

表2 胃癌组血清COL11A1表达与临床病理参数关系

3 讨论

在肿瘤微环境中，肿瘤细胞生长、迁移、侵袭等多种生物学过程离不开细胞外基质的支持［3］。胶原作为细胞外基质最重要的组成部分，参与了肿瘤的发生发展［4］。其中纤维性胶原含量最为丰富，如Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ和Ⅺ型。Shen等［5］发现发生淋巴结转移和复发性非小细胞肺癌组织中高表达COL11A1，介导Smad信号通路体外促进非小细胞肺癌细胞株增殖、迁移和侵袭。Jia等［6］认为COL11A1能够活化间质干细胞成为癌相关成纤维细胞，导致肿瘤生长和预后不良。有报道证实胃癌组织高表达COL11A1，可能调控CDK6等下游靶点促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，阻滞胃癌细胞凋亡［7］。这些数据提示，COL11A1可能是重要的肿瘤诊疗靶点。

肿瘤诊断标志物中酶类和蛋白质类的检测高度依赖于抗体的稳定性和特异性，而核酸检测方法成熟，且成本相对低廉［8］。实时荧光定量PCR通过指数扩增，检测到标本中的微量核酸，极大提高了灵敏度，广泛应用于液体活检研究，包括循环非编码RNA［9-11］、循环肿瘤细胞［12］、外泌体［13-14］等，具有重要的临床价值。本研究中，我们证实常规总RNA提取和实时荧光定量PCR法能够检测出血清中COL11A1的基因表达水平。同时，胃癌患者血清中COL11A1 mRNA的表达明显高于浅表性胃炎患者和健康体检者。

本研究分析了血清COL11A1表达与临床病理参数间的关系，发现COL11A1表达与肿瘤浸润深度和TNM分期密切有关。当肿瘤组织侵及浆膜层或浆膜下组织，甚至发生转移累及周围脏器时，血清COL11A1表达升高。提示COL11A1是参与肿瘤发展的重要分子。ROC曲线分析显示COL11A1的曲线下面积达0.811，表明COL11A1是良好的胃癌诊断指标。Giussani等［15］报道血浆 COL11A1是乳腺癌的生物标志物，也佐证了我们的结果。有研究报道［16］，CEA、CA199、CA724等传统肿瘤标志物在胃癌中的灵敏度分别为 54.34%、44.69%、48.73%，特异度分别为 75.45%、78.27%、84.94%。我们的结果显示，当临界值为1.583时，COL11A1的敏感性显著高于传统肿瘤标志物。因此，COL11A1有望成为一个有效的胃癌诊疗靶点。但是，COL11A1作为肿瘤标志物的参考范围是多少，能否与其他指标联合检测提高诊断效率，其与胃癌预后关系如何，仍需扩大样本量进一步深入研究。

综上所述，胃癌患者血清COL11A1基因高表达，且与肿瘤浸润深度和TNM分期密切相关，有望成为新的临床诊断指标。