甘草与附子不同比例配伍对甘草黄酮溶出过程的影响*

李芩萍 周 静 李 敏 孔 俐 韩 进 张宇燕

（浙江中医药大学，浙江 杭州 310053）

甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza inflate Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的根及根茎，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的功效［1］。甘草的主要有效成分是黄酮类化合物、甘草皂苷类和甘草多糖类化合物［2-3］，除具有肾上腺皮质激素样作用外，还有抗炎、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗心律失常、调脂等作用［4-10］。附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根加工品，首载于《神农本草经》，列为下品，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛的功效，用于亡阳虚脱及阳虚诸证［1］。配伍用药是中医特色之一，附子为回阳救逆要药，但有毒，甘草味甘、性平，能缓能解，故临床附子甘草多配伍应用［11］，如仲景四逆汤为治疗伤寒少阴寒化证的基本方，甘草在方中亦有十分重要的意义。甘草既能降低附子的毒性，又能加强姜、附的功能，3味药有机配伍，成为一首峻而不烈、功效卓著的回阳救逆名方。此经典搭配的增效减毒配伍关系引起医药研究人员的极大兴趣并进行了大量研究。同时张仲景及历代各医家使用甘草附子配伍剂量各有特点，发挥最佳药效［12-13］。本实验采用紫外分光光度法，以甘草苷为对照品建立甘草黄酮的含量测定方法 ，观察甘草与附子不同比例配伍对甘草黄酮的溶出过程及含量的影响，从分析化学探讨甘草与附子等中医药配伍对成分溶出及含量变化的影响，为中医药配伍研究提供参考也为临床用药提供了依据。现报告如下。

1 实验材料

1.1 实验药物 甘草药材：购自浙江临安市医药药材有限公司，经鉴定为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的根及根茎，批号20161025。附子药材：购自浙江临安市医药药材有限公司，经鉴定为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.的子根的加工品，批号 20161210。甘草苷对照品（111610-200604）：中国药品生物制品检定所。

1.2 实验仪器 TU-1900双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。AG135型电子天平：上海精密科学仪器有限公司。DGG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱：上海森信实验有限公司。FZ102微型植物试样粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取甘草苷标准品2.2 mg，加60%乙醇溶解，并用乙醇定容至50 mL，制得浓度为44 μg/mL的对照品溶液。

2.2 单煎液、甘草与附子合煎液的制备 分别取甘草5 g，甘草 5 g与附子 5 g，加水 20倍，浸渍 30 min，煎煮60 min时间后定容至50 mL，取定容溶液0.4 mL，加60%乙醇至8 mL，加10%氢氧化钠溶液1 mL，混匀，放置5 min，用60%乙醇定容至10 mL，作为甘草单煎，甘草与附子合煎供试液。

2.3 最大吸收波长的确定 精密吸取甘草苷对照品溶液0.5 mL，加60%乙醇至8 mL，加10%氢氧化钠溶液1 mL，混匀，放置5 min，用60%乙醇定容至10 mL，以第1份为空白对照，于190～500 nm波长处扫描，结果在337 nm处有最大吸收。

2.4 标准曲线的制备 分别精密吸取甘草苷对照品溶液 0.5、0.7、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，加 60%乙醇至 8 mL，加10%氢氧化钠溶液1 mL，混匀，放置5 min，用60%乙醇定容至10 mL，在337 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，对照品浓度（μg/mL）为横坐标，得线性回归方程 y=0.0712x+0.0248 （R=0.9994）， 在 2.20～11.00 μg/mL范围内甘草苷对照品浓度与吸光度呈线性关系。

2.5 精密度试验 取“2.4”项下标准溶液系列中质量浓度为6.60 μg/mL的溶液，重复测定6次，以吸收度计算RSD，考察精密度。结果RSD=0.40%，精密度符合要求，说明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 分别取对照品溶液、甘草单煎液、甘草与附子合煎液，于各样品制备后0、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h测定其吸光度，结果以吸光度计算RSD分别为0.24%、0.43%、0.55%，结果表明对照品溶液及各样品溶液在6 h内基本稳定。

2.7 重复性试验 依照“2.2”项下供试液制备方法 制备甘草单煎液，甘草与附子合煎样品液各5份。分别取甘草单煎液0.4 mL，甘草与附子合煎液0.4 mL，加60%乙醇至8 mL，加10%氢氧化钠溶液1 mL，混匀，放置5 min，用60%乙醇定容至10 mL。测定吸光度，计算甘草苷平均含量的RSD分别为1.51%、2.24%，结果见表1。

表1 甘草单煎液重复性试验结果（%）

2.8 加样回收试验 取已知含量的供试品（分别单煎和合煎），加入甘草苷对照品，依照“2.4”项下方法测定吸光度，计算回收率，结果见表2、表3，平均回收率分别为98.06%、97.99%。

表2 甘草单煎液甘草苷加样回收试验

表3 甘草与附子合煎液甘草苷加样回收试验

2.9 甘草与附子不同比例配伍对甘草黄酮溶出过程的影响 分别取甘草5 g，按表4与附子不同比例配伍，加水 20 倍，浸渍 30 min，分别在煎煮 0、5、10、20、30、45、60、75、90 min 时间后定容至 50 mL，取定容0.4 mL，按照标准曲线项下测定并计算甘草苷含量。结果见表4、图1，甘草与附子不同比例各配伍组，均随着时间变化甘草黄酮溶出增加，溶出变化趋势基本一致，且60 min后含量保持基本稳定。在同一时间点甘草与附子配伍后合煎比甘草单煎甘草苷的含量均降低，其中1∶3配伍时相同时间点甘草黄酮溶出明显比其他配伍组低，其他配伍组变化比较接近。

表4 不同比例配伍后不同时间甘草苷含量的测定结果（%）

图1 甘草与附子不同比例配伍后甘草黄酮动态溶出过程

3 讨 论

甘草黄酮是甘草的主要有效成分，测定甘草黄酮的含量可以控制甘草生药及含甘草制剂的质量［14-16］。二氢黄酮甘草苷是甘草黄酮的重要成分，在碱性条件下紫外最大吸收峰红移，减少溶剂的干扰。本实验采用样品中加碱液的方法 ，在337 nm处测定吸光度，得线性回归方程y=0.0712x+0.0248（R=0.9994），方法稳定，可靠，操作简便。

甘草与附子配伍后，能明显改变煎煮过程活性成分的含量变化。杨明等分析附子与甘草合煎后生成的沉淀，发现在生成的沉淀中除有酯型生物碱成分、甘草皂苷类成分，还有甘草黄酮类成分 （以甘草苷为代表）［17］。甘草苷属二氢黄酮类成分，含有7-羟基，而苷元甘草素含有7，4’-二羟基，均显酸性，易与附子中的生物碱（包括酯型生物碱）发生沉淀反应，从而可降低药液中酯型生物碱含量，起到降低附子毒性的作用。本实验研究表明，甘草与附子配伍后，甘草黄酮的溶出降低了，可能是甘草苷与附子中生物碱发生沉淀反应所致。本实验研究甘草与附子不同比例配伍对甘草黄酮溶出过程的影响，结果同时也表明，甘草与附子不同比例各配伍组，随着时间变化甘草黄酮溶出增加，60 min后含量保持基本稳定，且在同一时间点甘草与附子配伍后合煎比甘草单煎甘草苷的含量降低，不同配伍比例后含量动态变化规律基本一致，其中甘草与附子1∶3配伍在相同时间点甘草黄酮溶出明显比其他配伍组低。实验结果进一步证明了中医临床配伍的科学性与合理性，中医药配伍必须通过合理煎煮以降低毒性，增加疗效，发挥其特长，同时也有助于探讨甘草对附子的解毒作用的物质基础，初步为临床用药剂量设计及新药开发研究提供了依据。