抑制素免疫对崇明白山羊超数排卵效果的影响

葛 雷，吴彩凤，戴建军*，李 垚，吕玉华，陈 晓，张树山，张德福

(1上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；2上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106；3上海市农业遗传育种重点实验室动物遗传工程研究室，上海 201106；4上海交通大学医学院，上海200025)

抑制素(INH)是一种由动物性腺分泌的糖蛋白激素，能特异性作用于垂体，对基础的卵泡刺激素(FSH)分泌和促性腺激素释放激素(GnRH)刺激的FSH分泌具有抑制作用，且呈剂量依赖关系[1-2]。抑制素免疫是一种新型可增强动物繁殖性能的方法，其通过抑制素抗体与体内抑制素进行中和反应，从而降低抑制素对FSH分泌的抑制作用，进而提高动物体内FSH激素水平、促进排卵和提高胚胎质量[3-4]。抑制素免疫在羊上的研究主要集中在对排卵及产仔数的影响[5]，其对超数排卵(简称超排)影响的研究未见报道。本试验采用抑制素主动免疫配合常规超排方法，研究其对崇明白山羊的超排效果和激素水平的影响，以期提高超排效果，增加排卵点数量。

1 材料与方法

1.1 动物和药品

选择健康且发情周期正常的崇明白山羊，随机分为试验组和对照组，每组10头。试验组免疫制剂为含重组抑制素蛋白的油乳剂(江苏省农业科学院施振旦教授馈赠)。CIDR(阴道栓)购自新西兰，卵泡刺激素(FSH)、氯前列烯醇(PGF2α)和促黄体生成素(LH)均为宁波市三生药业有限公司产品。

1.2 抑制素免疫处理

试验组处理时，对选定的崇明白山羊臀部肌肉注射含重组抑制素蛋白的油乳剂，剂量为1 mL头，抑制素蛋白质量浓度为1 mgmL，免疫当天记为INH 1d。INH 21d按相同剂量对崇明白山羊进行二免处理。对照组注射不含重组抑制素蛋白的油乳剂，注射剂量、时间、频次和部位与试验组相同。

1.3 超数排卵和同期发情处理

于INH 21d(即加强免疫当天)对试验组和对照组羊埋植CIDR，INH 28d更换CIDR。INH 32d开始采用FSH三日递减法进行超数排卵处理，每天6：00和18：00各进行一次FSH肌肉注射。INH 34d上午6：00注射FSH后再注射PGF2α，同时撤出CIDR。INH 35d肌肉注射LH抑制素免疫、超数排卵方法及激素用量见表1。根据发情情况，选择合适发情时间与公羊自然交配。配种后48 h进行输卵管手术冲胚。

表1 抑制素免疫、超数排卵方法和激素用量

1.4 血清采集

于INH 31d、INH 39d颈静脉采血，另外在超排期间每隔6 h颈静脉采血一次。血液静置6 h后4 000 rmin离心15 min，收集血清，-80℃保存待测。

1.5 手术冲胚和排卵点观察

配种后48 h进行手术冲胚和胚胎收集。手术前禁饲禁水12 h，全身麻醉后前低后高仰卧保定，乳房前腹中线开口，常规方法打开腹腔，暴露子宫、卵巢和输卵管，记录排卵点数目。采用TCM199+5% FBS(胎牛血清)分别于两侧输卵管冲胚，静置后于显微镜下收集胚胎，记录每侧输卵管的胚胎数。

1.6 激素水平检测

血清中FSH、LH、抗缪勒管激素(AMH)激素水平测定按照上海润裕生物科技有限公司所生产的ELISA试剂盒说明书进行，孕酮(P4)和雌二醇(E2)水平测定按照Cayman Chemical Company(USA)生产的ELISA试剂盒说明书进行。

1.7 统计分析

利用SPSS 20.0软件对排卵点、冲胚数及激素水平进行均数检验，结果以“均值±标准误”的形式表示，P<0.05或P<0.01表明差异显著或极显著。

2 结果与分析

2.1 排卵点和冲胚数

试验组的单侧卵巢排卵点个数和单侧输卵管的冲胚数分别为11.69±1.40和9.88±1.64，均极显著高于对照组的8.20±1.44和6.92±1.62。

2.2 抑制素免疫对超数排卵崇明白山羊血清FSH和LH分泌的影响

从图1可以看出，抑制素主动免疫崇明白山羊可以显著提高其体内FSH水平。在FSH注射之前的INH 31d，试验组血清中FSH浓度与对照组有显著差异。在超排期间，试验组FSH水平显著高于对照组。发情时，试验组和对照组动物FSH水平均大幅升高，且试验组亦极显著高于对照组。INH 39d时，试验组和对照组血清中FSH水平开始下降，且两者之间没有显著差异。

从图2可以看出，抑制素主动免疫崇明白山羊对其LH的分泌没有显著影响。发情时，试验组和对照组LH水平有大幅升高，但无显著差异。INH 39d时，试验组和对照组血清中LH水平急剧下降，且两者间无显著差异。

*表示差异显著(P<0.05)；**表示差异极显著(P<0.01)；虚线部分表示未按每隔6 h进行血样采集和激素检测，下同图1 超排时血清FSH浓度的变化 Fig.1 Changes of serum FSH concentration in goats during superovulation

图2 超排时血清LH浓度的变化 Fig.2 Changes of serum LH concentrations in goats during superovulating

2.3 抑制素免疫对超数排卵崇明白山羊血清AMH分泌的影响

从图3可以看出，抑制素主动免疫崇明白山羊对其AMH分泌有短时间的影响。INH 31d和INH 33d时，试验组AMH水平显著高于对照组，其余时间点试验组较对照组高，但并无显著差异。

2.4 抑制素免疫对超数排卵崇明白山羊血清P4和E2水平的影响

从图4可以看出，PGF2α注射后，试验组和对照组血清P4水平均急剧下降。INH 34d时，试验组的P4水平显著低于对照组，其余时间无显著差异。INH 39d时，试验组和对照组P4水平有缓慢上升趋势，但两者无显著差异。

图3 超排时血清AMH浓度的变化Fig.3 Changes of serum AMH concentrations in goats during superovulation

图4 超排时血清P4浓度的变化 Fig.4 Changes of serum progesterone concentrations in goats during superovulation

从图5可以看出，抑制素主动免疫崇明白山羊对其E2的分泌没有显著影响。INH 36d时，E2水平迅速上升，两组之间无显著差异。INH 39d呈缓慢下降趋势，两组间亦无显著差异。

图5 超排时血清E2浓度的变化 Fig.5 Changes of serum oestradiol concentrations in goats during superovulation

3 讨论与结论

抑制素是一种性腺分泌的糖蛋白激素，主要来源于睾丸支持细胞和卵巢颗粒细胞，其主要生理作用是与激活素共同调控FSH的合成和分泌[6]。抑制素还可以通过其他如自分泌或旁分泌途径对性腺发挥局部影响作用，如优势卵泡可以通过旁分泌作用对周围卵泡产生抑制效果，从而使非优势卵泡发生卵泡闭锁[2]。

抑制素免疫是利用抑制素抗体免疫中和体内内源性抑制素，从而解除抑制素对FSH分泌的抑制作用，提高FSH水平，刺激未成熟卵泡发育。大量研究表明，抑制素免疫可以显著提高动物体内FSH激素水平，增加大卵泡数量，提高排卵率，从而提高动物繁殖能力[7-9]。而超数排卵技术可以诱导大量卵泡成熟排卵，增加可移植胚胎数，在家畜胚胎移植方面具有重要意义。抑制素免疫技术和超排技术均可以通过增加动物卵泡数量和提高排卵率来提高动物繁殖力，但两者结合使用的研究较少，目前仅在提高牛超排效果中有抑制素免疫的相关报道。覃广胜等[3]在水牛和桑润滋等[10]在荷斯坦母牛与西杂青年母牛上的研究发现，抑制素免疫结合超排可以提高牛的胚胎数和可用胚胎数。本试验也发现抑制素免疫能有效地抑制崇明白山羊体内内源性抑制素的活性，并持续、显著提高崇明白山羊超排期间的FSH激素水平，刺激未成熟卵泡发育，从而极显著增加排卵点个数和冲胚数，提高超排效果。

AMH作为一种可以评价人类卵巢状态的标记物，其水平可以预测卵巢状态和超排效果[11-13]。毕江华等[14]发现牛AMH浓度越高，超排效果越好，故AMH可作为临床预测动物卵巢状态、评价超排效果的指标之一。在抑制素免疫相关研究中，并未见关于AMH激素水平的研究。本试验通过检测AMH水平发现，抑制素免疫结合常规超排技术可以显著提高崇明白山羊体内AMH水平，此结果与排卵点数量增加相符，且能反映抑制素免疫可以增强超排效果。

抑制素免疫对其他激素如LH、P4、E2的影响仍存在争议。部分研究者认为抑制素免疫可以提高或降低动物体内LH激素水平[4,15]，但也有研究表明抑制素免疫并不会影响LH激素水平，仅会诱导提前出现LH峰，即免疫动物会提前排卵，但提前幅度较小[9,16-17]。本试验发现抑制素免疫并不会影响崇明白山羊体内LH激素水平，且并未出现LH提前升高的现象，这与桑润滋等在牛超排上的研究结果相一致[10]。由于LH对抑制素的敏感程度较FSH低，且合成相对较慢，同时超排时LH上升期较长，故不能观察到免疫动物LH提前升高。大部分研究发现抑制素免疫对动物发情期的P4水平没有影响，其主要影响体现在黄体期(即排卵后7d左右)免疫组P4水平会显著高于非免疫组[9,17-18]。本试验发现，试验组和对照组血清中P4水平均在PGF2α注射后迅速下降，且两组激素水平整体上无显著差异，仅在PGF2α注射时间点上试验组显著低于对照组，分析原因可能是由于超排时大量激素注射导致内分泌失调。故抑制素免疫对超排期间动物体内P4水平并无显著影响。E2水平能反映动物卵巢功能情况，较高的E2水平反映动物良好的受孕能力。抑制素免疫对E2激素水平的影响对不同动物而言存在差异，奶牛、山羊等动物上的研究发现其可以提高E2水平[18-20]，但对小鼠并没有显著影响[21]。FSH水平会影响E2水平的变化，本试验发现，随着FSH激素水平的上升，E2水平也显著升高，并未发现试验组和对照组之间E2水平有显著差异。桑润滋等[10]在类似试验中也并没有发现抑制素免疫结合超排能对牛体内E2水平产生影响。

本研究发现，在崇明白山羊的超数排卵过程中使用抑制素免疫能显著提高崇明白山羊FSH和AMH的激素水平，增加排卵点数目和手术后的冲胚数，达到有效提高超排的效果。