真空冷冻干燥对乳酸菌损伤机制的研究进展

李明慧，尚一娜，霍麒文，陈 境，张晓宁，邢叶妮，杨姝玉，王俊国*

（内蒙古农业大学食品科学与工程学院，乳品生物技术与工程教育部重点实验室，农业农村部奶制品加工重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018）

乳酸菌真空冷冻干燥是将乳酸菌细胞悬浮液冻结后，提高真空度使冰晶在低温条件下升华变成冻干粉状态的技术[1]。该方法主要是依据微生物的生理、生化特点，使菌株的代谢处于不活泼的状态，生长和繁殖受到抑制，达到休眠的状态，以保持菌株的原有特性[2]。真空冷冻干燥技术发明于20世纪60年代初期，现已在工业化生产中大规模使用。与其他保藏菌株的方法相比，经过冷冻干燥技术处理后的菌株含活菌数量较高，发酵活力较好，遗传特性较为稳定，同时它在储存和运输等方面成本较为低廉，因此冷冻干燥技术有助于菌体贮藏与应用[3-4]。

但冷冻干燥也会导致乳酸菌菌体活力下降甚至死亡[5-6]。为了探究冷冻干燥导致乳酸菌发酵剂失活的机制，国内外学者们进行了大量的研究，发现冷冻干燥后细菌的存活率以及发酵活力降低的主要原因有以下几个方面：冷冻和干燥过程造成的细胞膜通透性增加、膜流动性降低、细胞酶及相关蛋白质变性和核糖核酸结构变化等[7-8]。

尽管大量研究证明冷冻干燥会对乳酸菌的发酵活力造成一定程度上的损伤，并提出了相应的解决办法，但没有对其失活机制进行系统地分析，本文以细胞膜、酶、蛋白质以及遗传物质等为主要对象，对真空冷冻干燥的损伤机制进行了详细的总结，为制备冷冻干燥高效浓缩型乳酸菌发酵剂提供一定的参考。

1 冷冻干燥对细胞膜通透性的影响

1.1 冷冻干燥对细胞膜通透性的作用方式

细胞膜可以使菌体与外部环境隔离，是保护乳酸菌的主要屏障，因此膜是否完整、是否受损是冷冻干燥过程中最受关注的焦点[9]。

在冷冻干燥过程中，有许多因素会影响膜的通透性，进而造成细胞膜的损伤。这主要与冷冻过程中冰晶的形成以及干燥过程中磷脂双分子层的损伤有关。其中冰晶的形成有可能会导致细胞膜的机械损伤，这也是造成细胞死亡的主要原因。在冷冻干燥的预冻过程中，菌株内的游离态水冻结后会形成冰晶，一般冰晶越大，细胞膜越容易破裂，细胞越容易死亡；冰晶越小，对细胞膜的机械损伤也较小[10]。同时在冷冻过程中温度的波动也会使胞内冰晶发生重结晶，使冰晶变大，破坏细胞膜。

如图1所示，在冻结过程中，冻结速率的变化会导致细胞内外水分含量的变化，细胞悬液以1 ℃/min的速率降温至-20～-40 ℃，1 h左右达到冻结视为慢速冻结；而细胞悬液以10 ℃/min以上的速率降温至-20～-40 ℃，短时间内达到冻结视为快速冻结[11]。若冷冻速率较快，胞内水分还来不及外渗就被冻成冰晶，会造成冰晶体积过大使细胞受到机械损伤，这种胞内冻结形成的冰晶会对细胞产生伤害；若冷冻速率较慢，游离水在细胞外部形成冰晶，胞内水分则会外渗到胞外，细胞外形成的冰晶本身或冰晶形成的过程会对细胞造成较大的伤害。冷却速率的缓慢或快速是相对的，并且不同的菌株所需的冻结速率有所不同，因此针对不同菌株应选用最适于该菌株的冻结速率。采用最适冻结速率进行冷冻时，虽然菌体细胞内的水分会渗透到细胞外，但细胞体积收缩较小，结构仍与原来相似，且降低了菌体细胞的发酵活性，因此对细胞产生的伤害远远小于大量水分在胞内冻结所产生的伤害[12]。

图 1 冻结速率对冰晶形成的影响[13]Fig. 1 Effect of freezing rate on crystal growth[13]

除此之外，冰晶对乳酸菌的影响还与菌体的形状有关。通过对比相同条件下的球菌和杆菌的冻干存活率，发现菌体表面积越大的细胞存活率越低，而且细胞的表面积越大，在冷冻过程中形成的冰晶对膜的损伤越大[14]。

细胞膜中磷脂的极性端在一定程度上以水合形式存在，而且每个磷脂的极性端与其他磷脂分子的极性端被水分子隔开，当磷脂干燥脱水时，以氢键相连的水分子从磷脂双分子层的头部基团移走，头部位置出现空位，酰基会强加到头部空位上，链间范德华力增强，而且磷脂分子会由液晶相向凝胶相转变；因此磷脂分子间可能出现空位，膜的渗透性加大，使细胞内的酶泄漏及胞内蛋白质溶出等，进而导致细胞活力下降，产酸性能降低[15]。Basholli-Salihu等[16]通过对比冷冻和冷冻干燥的菌体活性以及细胞膜内外酶活力发现，菌体经过冷冻干燥后其酶活力及发酵活力的下降程度均高于冷冻样品，说明干燥过程中细胞失水造成的损伤会导致菌的活力进一步下降。

前人研究发现冷冻干燥后保加利亚乳杆菌细胞膜的通透性出现损伤，细胞内外离子发生转移，细胞内部的离子环境发生改变；因此可依据这种离子浓度的改变，评价细胞膜损伤的情况[1]。王飚等[17]通过特异性荧光探针法测定了冷冻干燥过程中细胞膜对H+和Ca2+的通透性变化，研究了乳酸菌细胞膜在冷冻干燥过程中完整性的变化；结果显示，与冻干前相比，冻干后细胞内pH值明显下降，胞内外pH值梯度遭到了破坏，细胞膜对H+的通透性增大；另外，冷冻干燥也会导致细胞外的钙离子浓度增加，亦说明细胞膜的通透性增大。同时有研究还发现β-半乳糖苷酶活力的高低能反映细胞膜通透性的改变情况，通过测定细胞内渗出胞外的β-半乳糖苷酶活力可判定细胞膜损伤的情况。经研究，对比添加保护剂和未添加保护剂的胞外β-半乳糖苷酶活力，发现未添加保护剂的胞外β-半乳糖苷酶活力更大；说明冷冻干燥会造成细胞膜通透性增大，造成菌体发酵活力下降[18-19]。

1.2 减少细胞膜损伤所采取的措施

近年来有学者通过调整冷冻温度和速率减小冰晶体积，从而减轻细胞膜损伤对菌体造成的不利影响。李宝磊[19]通过测定冷冻干燥后的Streptococcus thermophilus SP1.1发酵活力，发现经过液氮（-196 ℃）冷冻处理后的菌体发酵活力变化最小；这是由于胞内游离水在超高速冷冻速率下形成微晶体，减少了对细胞膜的损伤。所以选择合适的预冷冻速率对菌体活力的提高也尤为重要。

以脱脂乳作为冻干保护剂可以稳定细胞膜的结构，减少或防止冷冻干燥对细胞的损伤，而且细胞在复水时也可防止膜受到冲击。另外在脱脂乳中添加其他成分的复合保护剂可以成倍地增强对菌体的保护作用。曾小群等[20]采用脱脂乳复合保护剂，制备出Lactobacillus casei冻干存活率达98.74%的高活性酸奶发酵剂。增加Ca2+与吐温-80的添加量，可以达到维持细胞膜流动性的作用，对菌体的冻干存活率有显著提高作用[21]。添加甘油也可以保护细胞膜的完整性，因为甘油具有很强的亲水性，能够稳定细胞膜的结构，减少或防止细胞遭受干燥脱水的损伤，并且细胞在复水时也可防止膜结构受到冲击[22]。

2 冷冻干燥对细胞膜流动性的影响

2.1 冷冻干燥对细胞膜流动性的作用方式

细胞膜的流动性对于细胞的物质运输、细胞识别、细胞免疫、细胞分化与信息转导等都有着重要意义。低温条件下，磷脂分子由于脂酰链的相互靠近产生疏水间力，使磷脂分子呈有序的刚性状态，即凝胶态；随着温度的升高，脂酰链因布朗运动加强而排列疏松，脂双层呈现相对无序状态，即液晶态（图2）。两种状态的转变温度称为相变温度，在冷冻干燥过程中，伴随着水分含量的减少，磷脂分子会由液晶态向凝胶态转变，造成磷脂分子流动性下降。膜的流动性受磷脂分子脂酰链饱和度和长度的影响，饱和度较高时脂链延展充分，更易借助范德华力相互靠近形成晶状体列阵，同时脂酰链越长，越易通过疏水力相互聚合成稳定的凝胶态，导致细胞膜流动性下降[23]。

图 2 水分含量与相转变关系图[13]Fig. 2 Relationship between moisture content and phase transition[13]

细菌本身可以通过自我调节来克服细胞膜流动性下降对其造成的不良影响，主要有两个途径：增加胆固醇在生物膜中的比例以及调节饱和/不饱和脂肪酸的比例。胆固醇对生物膜的流动性具有双向调节作用。当膜的流动性过高时，胆固醇的增加可以调节膜的流动性和通透性，从而使膜趋于晶胶态；当膜的流动性过低时，胆固醇可以通过调节使磷脂分子排列更加有序，增强膜的流动性[24]。

在冷冻过程中，乳酸菌可以通过乳酸脱氢酶调节饱和/不饱和脂肪酸的比例。细胞膜脂肪酸成分是影响细胞抗冷冻性的重要指标。脂肪酸的不饱和指数决定了细胞膜的黏度和厚度，高含量的不饱和脂肪酸可以提高细胞膜对冻干的抵抗力[4]。冷冻干燥后乳酸菌细胞膜上的饱和脂肪酸含量下降，而不饱和脂肪酸含量增加；这是由于在相对低的温度下，细胞膜中乳酸脱氢酶的活力增加，使不饱和脂肪酸含量增加，膜的流动性增强，不饱和脂肪酸中顺式双键的存在阻止了脂肪酸分子间的整齐排列，这种排列会导致脂肪膜的流动性下降[25]。

尽管不饱和脂肪酸含量的增加在冷冻过程中可以提高细胞膜的抗冷冻能力，但这些不饱和脂肪酸在有氧条件下储存过程中也易发生氧化。Hansen等[26]认为细胞膜脂质氧化会对细胞的生存机制造成很大影响。由于不饱和脂肪酸亚甲基上的氢原子较为活泼，易被自由基夺走，产生脂质自由基，与氧气结合形成脂质过氧自由基，不断的循环造成脂质链不断延长，导致不饱和脂肪酸含量的减少，降低细胞膜的流动性，影响细胞膜的结构和正常生理功能；脂肪酸氧化产生的自由基对细胞膜的影响还体现在自由基引入亲水基团后降低了磷脂双分子层的疏水性，由于脂双层的疏水端通过疏水力的作用相互聚拢，自动组装成双分子层，而疏水力的降低导致组装脂双层的驱动力降低，使脂双层结构变得不稳定；同时自由基引入的亲水基团也会削弱磷脂双层与内在蛋白质的疏水相互作用，由于细胞膜内蛋白是通过非极性氨基酸残基与膜脂分子的疏水作用而插入脂双分子层中，因此疏水作用减弱使内在蛋白（包括膜锚蛋白）的嵌入和移动受到影响，进而影响到细胞膜的功能，而且自由基也可以直接诱导DNA出现损伤。Kandil等[27]也认为膜脂肪酸的氧化是造成微生物细胞在储存过程中死亡最主要的原因。膜脂肪酸氧化的程度与细胞膜内不饱和脂肪酸及饱和脂肪酸的比值有关[28]。

在冷冻干燥过程中，有些乳酸菌可以将不饱和脂肪酸转变为环状脂肪酸。Velly等[29]认为细胞膜中的环状脂肪酸有助于提高菌株的抗冻能力。在冷冻过程中，菌体以不饱和脂肪酸（棕榈油酸、异油酸和油酸等）为底物快速合成环式脂肪酸，这个过程是通过对不饱和脂肪酸的一个顺式双键进行环丙烷化修饰来实现的。Munoz-Rojas等[30]认为细胞膜中环丙烷脂肪酸含量的增加可以提高菌体细胞膜的流动性。而且环丙烷脂肪酸的化学性能稳定，一旦形成，就会起到稳定细胞膜组成成分的作用；环丙烷脂肪酸的抗氧化能力较强，化学反应活性较低[31]。因此，可以推测细胞膜中环丙烷脂肪酸的积累对菌体提高抗冷胁迫能力可能具有积极的作用。

2.2 改善细胞膜流动性的方法

研究发现可以通过改变培养基成分或培养条件改善细胞膜的流动性。人们发现在低酸环境下生长的乳酸菌，在冷冻干燥时细胞膜的流动性保持的更好。Wang Yu等[32]发现，低pH值条件可以有效改善膜的流动性，使得保加利亚乳杆菌能够更有效地抵抗冷冻伤害。Palmfeldt等[33]研究表明，培养基pH值为5时，罗伊氏乳杆菌有较强的抗冷冻性，而pH值为6时抗冷冻性较差，说明低pH值可以增强菌株的抗冷冻性。此外对不饱和脂肪酸的成分进行分析发现，较低的pH值可以引起细胞内不饱和脂肪酸的积累。Li Hua等[34]认为发酵结束时低的培养基pH值，更有利于合成环丙烷脂肪酸，可起到提高冷冻干燥存活率的作用。

在培养基中添加一些其他成分也有利于提高细胞膜中不饱和脂肪酸的含量，使细胞膜保持好的流动性。Fonseca等[35]的研究表明，在培养基中添加吐温-80可以改善乳球菌和乳杆菌的活性，增加细胞膜中不饱和脂肪酸的组成，从而改变细胞膜的流动性，减少冷冻干燥过程中的死亡率。

细胞膜脂肪酸氧化的后果是自由基的形成，这是细胞死亡的主要原因之一。因此为防止细胞膜中不饱和脂肪酸在贮藏期间的氧化，预培养过程中在培养基中添加微量元素、VE、VC等也有利于清除自由基来减少氧化反应。同时处理冷冻干燥样品的过程中避免高氧、辐射、化学污染以及不良环境因素有助于减少不饱和脂肪酸的过氧化反应。添加冷冻干燥保护剂也是在处理冻干样品中不可或缺的一步，谷胱甘肽能够清除掉细胞内的自由基，是一种重要的抗氧化剂，其通过巯基与自由基结合，可直接使自由基还原成酸性物质，从而加速自由基的排泄，并能激活多种酶从而促进糖类、脂肪和蛋白质代谢。

3 冷冻干燥对酶类物质及蛋白质的影响

3.1 冷冻干燥对酶的影响

研究发现细胞内酶的活力决定了细菌的物质、能量代谢和生长速度[27]。而冷冻干燥会导致一些乳酸菌的酶活力显著降低，如过氧化氢酶、乳酸脱氢酶、磷酸甘油脱氢酶、ATP酶、脂酶等，这会对菌体的活性造成影响，甚至导致其死亡。造成酶活力降低的主要原因是溶质的浓缩效应和细胞的脱水效应。在冻干过程中，水的冻结及蒸发使得细胞间隙内的溶质逐渐被浓缩，电解质的浓度随之增加，由于细胞内的蛋白质对电解质极为敏感，尤其是高浓度的电解质存在时会引起蛋白质高级结构的改变[36]，进而导致酶丧失其功能，造成菌种的活力下降[37]。

冷冻干燥会使一些维持胞内pH值的酶类失活[38]。例如，K+-ATPase可以使横跨膜产生电势，K+与H+互换，起到维持pH值梯度的作用，而冷冻干燥使K+-ATPase失去了这种作用，破坏了pH值的动态平衡，导致胞内pH值的降低，从而影响了酶的活力。另外，ATP合成酶要通过质子梯度为ATP的合成提供能量[39]；冷冻干燥后这种质子梯度被破坏，ATP合成酶的活力减弱，对菌体细胞的生理功能造成影响。冷冻干燥造成的酶活力降低会影响乳酸菌的生长，通过研究德氏乳杆菌保加利亚亚种的冷冻损伤机制，人们发现受冻菌体的结构损伤引起氨基酸转运相关的酶活力降低，合成蛋白质的速度变慢，代谢受到影响[2]。冷冻干燥对乳酸脱氢酶也有显著性的影响，因此可以通过测定乳酸脱氢酶的活力来探究冷冻干燥对酶造成的损伤[40]。Li Chun等[41]指出冷冻过程中乳酸脱氢酶的失活是乳酸菌损伤的一个主要因素。乳酸脱氢酶是乳酸菌代谢的关键酶，正常发酵过程中，乳酸脱氢酶催化丙酮酸还原为乳酸，其活力大小反映了菌株的产酸能力和能量代谢能力。

3.2 冷冻干燥对蛋白质的影响

干燥过程会导致由脱水引起的细胞失活[42]，失水会破坏蛋白质与水分子、细胞膜之间的相互作用力，导致维持蛋白质正常三级结构的作用力减弱，酶活力丧失，从而引起蛋白质构象发生改变，使其丧失功能[43]。在冻干细胞内维持一定的水分含量是非常重要的，水分含量过低会导致细胞出现不稳定和失活[44]，但水分残留过多时会引起细胞死亡。干燥后残余水分质量分数太高（高于5%），残留的自由水和细胞的蛋白质相互作用可造成蛋白质特定构象改变，从而影响菌体的冻干存活率。同时冻干产品过高的水分含量会大大降低乳酸菌的储存稳定性，缩短其储存期。

3.3 维持酶及蛋白质结构稳定性的措施

当微生物细胞正常生理代谢出现异常时，大量的不利物质积累，这会对细胞内酶活力产生较大影响。为了抑制冷冻干燥过程中酶类物质的失活及蛋白质结构的改变，细胞本身会产生相应的应激反应。低温条件下产生的冷应激蛋白和蛋白酶能提高酶类物质的活性及蛋白质结构的稳定性，并能维持DNA的超螺旋结构及转录、翻译功能，降低冷冻干燥对乳酸菌的损伤。Sanders等[45]的实验结果表明，乳酸乳球菌在8 ℃冷应激处理48 h后的存活率比没有冷处理的高20%。

除了自身应激反应之外，当冻干脱水时，添加含有多羟基结构的保护剂能够代替水分子的位置，并以“水化膜”的形式包裹在蛋白表面，从而起到维持蛋白质结构和功能的作用[40]。在干燥和贮藏过程中，保护剂被广泛用于稳定蛋白质。张玉华等[46]发现海藻糖通过氢键能够作用于蛋白质，代替失去的水与极性基团作用，维持菌体细胞的原有结构和功能，提高菌体的冻干存活率。

4 冷冻干燥对遗传物质结构稳定性的影响

4.1 冷冻干燥对遗传物质的作用方式

在冷冻干燥过程中，遗传物质的损伤是细胞丧失活力的重要因素之一。原核生物的遗传物质都是以蛋白质包裹DNA的复合形式存在的，冷冻干燥过程会引起蛋白质变性，导致DNA双螺旋结构的稳定性下降。在冷冻干燥过程中，水分含量的减少会导致溶质浓度增加和电荷变化，使DNA内部碱基对间的疏水作用减弱，影响遗传物质的稳定性[47]。当相对湿度降到75%时，DNA的双螺旋结构会发生可逆变化，而相对湿度在65%以下时，DNA的超螺旋结构就会被破坏，从而导致其空间构型发生变化。乳酸菌DNA超螺旋结构稳定性的下降会影响遗传物质的转录、翻译和DNA复制过程的破坏，进而导致菌种突变体的产生[48]。

干燥脱水过程会造成DNA双螺旋结构中碱基对间的氢键断裂，而氢键断裂会使DNA的糖苷键断裂，使DNA发生脱嘌呤和脱嘧啶反应，影响核苷酸的组成，导致DNA的修复酶发生错误，从而影响蛋白质和酶的活力[49]。同时过度干燥会除去细胞中的自由水、结合水以及结构水，使其表面的亲水基团失去保护，直接和外界环境（包括O2）作用，造成DNA的结构出现损伤。

为了探究冷冻干燥后D N A的结构变化，Santivarangkna等[50]利用傅里叶变换红外光谱技术研究了真空干燥对瑞士乳杆菌细胞的影响，脱水导致的DNA超螺旋结构改变是造成细胞生理损伤的主要原因之一。

4.2 提高遗传物质抗冷冻稳定性的方法

为了防止DNA结构的改变，菌体细胞在极端不利环境下，会产生冷冻诱导蛋白质，这种蛋白有助于维持DNA超螺旋结构，并且使细胞能更适应低温下的转录与翻译[51]，从而提高了细胞对冷冻干燥的抵抗力。通过微胶囊包埋也可以维持乳酸菌细胞遗传物质的稳定性，Hlaing等[52]通过傅里叶变换红外光谱测定鼠李糖乳杆菌微胶囊细胞的光谱变化，证明微胶囊可以对菌体细胞内的蛋白质和DNA结构起到保护作用。此外Wang Lijun等[53]也证实菊粉微胶囊可以在冷冻干燥过程中对菌体遗传物质稳定性起到保护作用，并有效地提高了菌体的益生作用和菌种活力。

5 结 语

冷冻干燥过程虽然会引起菌体的失活甚至死亡，但在乳酸菌保存方面依然起到了很大的作用，通过探究乳酸菌的失活机制，并根据菌体的生理生化特点采取恰当的方法可以提高菌株抗冷冻干燥性能。