羊口疮病毒ORFV/GD-QY/01株的分离鉴定

向 蓉，翟少伦，王晓虎，陈 晶，黄 元，黄 忠，向 华

（广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，广东 广州 510640）

羊口疮，又称羊传染性脓疱，是由羊口疮病毒（Orf virusk, ORFV）引起的绵羊和山羊的一种接触性传染病，具有嗜上皮性，以口唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水疱、脓疱和结成疣状结痂为特征。ORFV属于痘病毒科副痘病毒属，是一种人兽共患病原，羔羊对其最为敏感，麝牛、鹿和人也可感染［1］。羊口疮最早发现于欧洲，现已广泛分布于全世界［2］。我国也越来越常见该病的报道，新疆、甘肃、青海、内蒙古及东北三省主要养羊地区均有该病发生和流行［3-8］。随着养羊业的发展以及羊只引种等交易频繁，广东省也陆续有羊口疮的发病报道［9-10］。羊口疮传染性强，流行迅速，一只羊患病即可感染全群，导致巨大的经济损失。因此对该病及早诊断和治疗尤为重要。羊口疮病变特异，初步诊断不难，但要确诊还需进一步诊断。目前已建立不同类型的PCR检测方法，扩增的靶基因主要是B2L囊膜蛋白基因等。ORFV基因组中，BamH I酶切片段的B2L基因是一个完整的阅读框，又称为ORFV011，蛋白编码蛋白质大小为42 ku。该蛋白是病毒囊膜蛋白，可刺激淋巴细胞诱导强烈的抗体反应，B2L基因在ORFV中相对保守，能够刺激淋巴细胞增殖，引发机体产生较强的免疫应答，是ORFV重要的保护性抗原［11-13］。

2016年6月，广东省清远市某羊场的羊只疑似发病，本课题组赴羊场采样，发现病羊在口唇和舌头处发生溃疡、生疮，有的已形成痂皮或疣状病变（桑葚状痂垢），发病率较高，但死亡率低。根据临床特征、病理变化和PCR检测，诊断为羊口疮。为了获得致病毒株，本试验对病毒进行了系统的分离鉴定，并对该病毒的B2L基因与其他毒株的序列进行比对分析和遗传进化分析，以期了解广东地区ORFV流行毒株的基因分子特征，以及与其他毒株的亲缘关系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

阳性对照为购自山东泰丰的疫苗毒。MDBK细胞株由本实验室保存，病料为广东省清远市某羊场疑似羊口疮发病山羊的唇部痂皮。

主要试剂和仪器：Premix TaqTM、100 bp NDA Ladder（Dye Plus）、DNA Marker DL2000、pMD-18T载体等购自TaKaRa公司，病毒RNA/DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自美基生物科技有限公司，DMEM高糖培养基、胎牛血清为Gibco公司产品。PCR扩增仪为美国BIO-RAD公司产品，凝胶成像分析系统（Tanon 1600）为上海天能科技有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 病料处理 将采回的病羊痂皮病料用无菌剪刀剪成适宜大小，无菌1×PBS缓冲液反复漂洗3次，完全剪碎后加PBS缓冲液进行研磨，研磨液制成1∶10的悬液，加青霉素、链霉素各2 000单位/mL，-20℃反复冻融3次，然后4℃浸毒过夜，3 000 r/min离心30 min，取上清液，再用孔径0.45 µm的滤器过滤，备用。

1.2.2 病毒分离和培养 MDBK细胞用含10%FBS的DMEM培养基传代培养至状态良好，待细胞铺满细胞瓶单层，用1×PBS缓冲液清洗细胞2～3次，弃掉缓冲液。接种1.2.1中处理好的病毒液1 mL，37℃ CO2培养箱中感作1 h，弃去病毒液，1×PBS缓冲液清洗细胞1～2次，再加入含2%FBS的DMEM维持液37℃继续培养，此后每天观察细胞生长和细胞病变情况，同时设正常细胞对照。当出现80%细胞病变时收毒，-20℃冻融3次，收集病毒液，同时继续传代。若细胞在接种病料后5 d内未出现病变则连续盲传3代，若第5代仍未病变视为阴性。

1.2.3 引物设计与合成 参照文献［14］针对羊口疮病毒的免疫囊膜蛋白B2L基因设计1对特异性引物，由Invitrogen公司合成。

上游引物 B2L（UP）：5' ATG TGG CCG TTC TCC TC 3'

下游引物 B2L（DN）：5' TTA ATT TAT TGG TTT GCA GAA CT 3'

1.2.4 病毒PCR鉴定 按照病毒RNA/DNA提取试剂盒说明书操作，从疫苗毒、病料痂皮和第1～6代传代细胞病毒液中提取DNA。以提取的病毒基因组DNA为模板扩增目的片段，PCR扩增反应体系为：2×Premix TaqTM25 µL、B2L上下游引物各2 µL、DNA模板6 µL、ddH2O 15 µL，反应条件为 94℃ 5 min；94℃ 30 s、53℃30 s、72℃90 s，30个循环；72℃10 min。取6 µL PCR产物在8 g/L琼脂糖凝胶上电泳，检测扩增结果并拍照。

对PCR产物进行切胶回收后与pMD-18T载体连接，挑取阳性克隆送Invitrogen公司测序。将测序结果在NCBI中进行BLAST比对分析，同时应用DNA Star软件的MegAlign对分离株B2L基因的测序结果进行生物信息学分析，包括将获得毒株的B2L基因核苷酸序列和NCBI中其他羊口疮毒株B2L基因进行多序列比对以及构建系统发育进化树等。

2 结果与分析

2.1 病毒分离及培养

病料悬液接种MDBK细胞后第1代未出现病变，72 h时收毒并盲传第2代，从第2代开始出现细胞病变，病变时间出现在48 h左右，继续传到第6代时细胞病变时间变得规律，细胞病变时间出现在40 h左右，细胞病变表现为：胞核浓缩、变圆、团聚、拉网、最后脱落，对照细胞表现正常（图1）。继续传代至第12代，且随着传代次数的增加出现细胞病变也更加规律，将该病毒分离株命名为ORFV/GD-QY/01。

图1 MDBK细胞接种前后表现

2.2 PCR检测及测序结果

以疫苗毒阳性对照、原病料痂皮和分离毒第1～6代病毒液分别提取的病毒基因组DNA为模板进行PCR扩增，结果（图2）显示，扩增出1 137 bp左右的目的基因片段，与预期片段长度相符。目的片段测序结果见图3，序列经BLAST核酸序列搜索后，显示与测序序列相似性高的均为ORFV核酸序列，说明分离病毒为ORFV。

图2 痂皮及细胞毒中B2L基因PCR扩增结果

图3 ORFV/GD-QY/01的B2L基因全序列

2.3 序列分析及系统进化树构建结果

从NCBI中下载国内外发布的ORFV不同毒株B2L基因序列，与分离株ORFV/GD-QY/01的B2L基因序列进行比较分析，利用DNAStar软件计算遗传距离，根据遗传距离绘制遗传进化树。遗传进化树（图4）结果显示，ORFV/GD-QY/01分离株与台湾分离毒株（EU935106、DQ904351）的亲缘关系最近，处于同一分支上。

3 结论与讨论

图4 B2L基因系统进化发育树

ORFV的B2L基因序列高度保守，有文献报道，不同来源的羊口疮病毒B2L基因仅有个别碱基的差别。因此，保守的B2L基因常用于鉴定该病毒。本研究根据病羊表现的典型临床症状初步诊断为羊口疮，为确诊病原，针对B2L基因设计1对特异性引物对病毒进行检测和鉴定。病料痂皮样本的PCR扩增结果显示，产物条带与预期目的基因大小一致，测序结果也证实序列为ORFV的B2L基因，因此可以确定病料中含有羊口疮病毒。将病料研磨上清液接种MDBK细胞，从第2代开始出现典型的CPE，一直传代到第12代，一直存在规律的CPE。第1～6代的细胞毒同时进行PCR检测，扩增条带均与预期目的基因大小一致，经测序鉴定为ORFV的B2L基因，表明从清远羊场病羊痂皮中分离获得1株羊口疮病病毒（ORFV/GD-QY/01）。

B2L基因产物经回收测序后，将测序结果与国内外发表的ORFV不同毒株相应的核苷酸序列进行遗传进化分析，结果表明ORFV/GDQY/01株B2L基因与台湾山羊分离株（DQ904351和EU935106）亲缘关系最近，相似性为99.2%，其次是国内福建株和陕西株等，分别为99.0%和98.4%，与国外如北美和拉丁美洲等的分离株的同源性较低，低于93.0%。这表明B2L基因虽然高度保守，但随着空间距离的扩大，在遗传上仍存在一定差异，可能是由于病毒在不同地域环境下进化过程中的变异所致。

广东省养羊规模逐渐壮大，尤其政府对牛羊养殖的鼓励政策刺激了养羊业的蓬勃发展，但目前依然存在肉羊上市量满足不了市场需求的现状［15］，其中一个重要原因就是各种羊病频发，以及缺乏对疾病防治的技术和经验。羊口疮是一种人兽共患病，其病原体具有高度的嗜上皮性，引起感染部位皮肤以及粘膜增生性病变。目前，对该病的发病机制尚不清楚，但各国已经使用分子生物学的方法进行疾病诊断，并加紧进行病毒分子生物学研究和基因工程苗研究［16-17］。本研究利用MDBK细胞从发病羊场成功分离到一株羊口疮病毒，为今后进一步研制羊口疮疫苗和检测试剂打下了良好的基础，进而为该病的防控提供了技术保障。