电针诱导大麻素受体表达参与展神经修复的相关研究

王蕾 张毅 王旭东 叶子

针灸是一种治疗疼痛的古老康复疗法，其良好的止痛效果及修复功能已在临床实践中被证实[1]。基于传统手工针灸改良后的电针也已被广泛应用并作为经典针灸的替代治疗[2]。前期研究认为电针刺激可以明显促进损伤的展神经恢复，但是相关机制尚不明确[3]。小胶质细胞作为中枢神经系统的固有免疫细胞，既可以促进神经修复，又能产生细胞毒性，其双重特性可能与不同表型及功能相关[4]。根据表型小胶质细胞分为M1、M2型，小胶质细胞在应激损伤环境中活化为M2型调节免疫炎症损伤反应，尤其小胶质细胞上的大麻素2型受体（cannabinoid receptor type 2，CB2R）不仅可以调控小胶质细胞增殖、分化和迁移，还可通过激活CB2R降低其神经毒性反应，另外大麻素1型受体（cannabinoid receptor type 1，CB1R）能影响多种分子的表达诱导脑缺血耐受，亦具有神经保护作用[5,6]。那么电针的抗伤害作用是否由CB2R激活介导参与，CB2R激活电针治疗是否影响展神经修复。基于此本文以电针为核心，利用小胶质细胞为切入点，采用Western blot、免疫荧光分析技术，通过运用CB2R拮抗剂AM630探讨电针是否通过CB2R介导调控小胶质细胞M2型表达促进损伤展神经修复。

材料与方法

一、实验动物及分组

选用普通级健康Beagle犬25只（6月龄），雌雄各半，体质量（15±0.5）kg，由南通大学医学院动物实验中心提供，许可证号SCXK（苏）：2008-0010。实验动物饲养于单独的犬房，可自由走动，12 h给予光照-黑暗的周期循环模式，保证适宜的温度进行饲养，饲养2周进行实验。实验动物治疗4周取材，动物的处理遵守国家健康协会制定的实验动物使用指南。

实验分组：随机分为5组，每组5只；前3组为假手术组（A组）、损伤组（B组）、电针处理组（C组）进行小胶质细胞大麻素受体的检测，其余为拮抗剂组（D组）、溶剂组（E组），5组均进行小胶质细胞标记分子的检测。A组：Beagle犬麻醉后，仅暴露分离展神经，术中不进行神经损伤处理，缝合切口皮肤，在其他组电针刺激时进行束缚，连续2周，每次持续15min；B组：Beagle犬麻醉后，制作展神经损伤模型，在其他组电针刺激时进行束缚，连续2周，每次持续15 min；C组：Beagle犬展神经损伤模型建立后进行电针刺激，连续2周，每次持续15 min；D组：CB2R拮抗剂AM630+展神经损伤+电针刺激，每次电针刺激前3 h给予溶剂 3 mL/kg（ip）进行腹腔注射；E 组：Vehicle+AM630+展神经损伤+电针刺激，在每次电针刺激前30 min给予溶剂3 mL/kg（ip）进行腹腔注射。

二、主要实验试剂

放射免疫沉淀试验（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液（上海碧云天生物科技有限公司）；苯甲基磺酰氟（南京生兴生物科技有限公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京康为生物科技有限公司）；兔抗 CB1多克隆抗体（Santa Cruz公司，美国）；兔抗 CB2 多克隆抗体（Santa Cruz公司，美国）；βtubulin单克隆抗体（Santa Cruz公司，美国）；Alexa Fluor 647标记山羊抗兔IgG二抗（Sigma公司，英国）；磷酸缓冲盐溶液（上海碧云天生物科技有限公司）；鼠抗 CD11b单克隆抗体（Serotec，Oxford公司，英国）；兔抗Arginase多克隆抗体（Abcam公司，英国）。

三、实验方法

1.展神经损伤模型的建立：所有Beagle犬术前12 h禁食后注射3%戊巴比妥钠（1 mL/kg）静脉麻醉。将Beagle犬置于手术台进行侧卧位，固定其头颅，耳缘牵向尾侧固定，麻醉充分开颅后皮瓣翻向外侧切除大脑半球，保留中脑组织，经颞肌附着处纵向切开。经颞底入路开颅，骨窗尽量靠近颅底，扩大骨窗范围（从眶后到颧弓前），并沿颞骨窗下缘切开硬脑膜沿斜坡向上外方做一创口约3.5 cm×3.5 cm。经岩颞韧带下方进入海绵窦充分暴露深部的展神经。用有齿止血钳挤压夹闭展神经30 s后，直视钳压处组织菲薄，切断展神经轴突但维持神经鞘膜完整性，以犬眼球呈内斜视为造模成功。

2.电针刺激：展神经损伤模型制作完成后，将2个电极（5F导管）分别置入神经损伤处两侧；向外方牵拉上下眼睑，在睑板与球结膜交界处充分暴露外直肌，将电极均插入外直肌，植入深度约3.0 mm，间距约4.0 mm，缝合切口固定电极。游离端自眼眶后下方引出固定，形成回路，术后连续2周给予电针刺激，每次持续15 min。参数设置：脉冲频率为5 Hz，时程0.1 ms，强度1.0 V。A、B组仅束缚，不刺激，其他3组进行电针刺激，参数设定一致。

3.Western blot检测小胶质细胞大麻素CB1R、CB2R表达：首先将A、B、C 3组进行Western blot检测，查看CB1R、CB2R分别在3组展神经小胶质细胞中的表达。将3组所有Beagle犬用10%水合氯醛进行深度麻醉后，迅速用手术剪剪下展神经节段，冰浴分离出少许神经组织置于1 mL匀浆器球状部位，尽量充分剪碎组织加入RIPA裂解缓冲液与苯甲基磺酰氟（1 mmol/L）混合30 min。收集裂解液并在4℃以12 000 r/min离心15 min，取上清分装置于-20℃保存，提取小胶质细胞的总蛋白，蛋白质含量用量化增强的BCA蛋白浓度测定试剂盒，蛋白质样本煮沸5 min，装载缓冲液并进行蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳，后将蛋白质电转移到聚偏二氟乙烯膜膜上， 取出膜放至 5%TBST（Tris-Hcl，NaCl，tween20）脱脂奶粉，以60 r/min的速度封闭2 h，经过漂洗加入下列抗体：兔抗CB1多克隆抗体（1∶200）或兔抗 CB2多克隆抗体（1∶200）和 β-tubulin单克隆抗体（1∶200），放置 4℃冰箱孵育过夜，TBS 漂洗后加入Alexa Fluor 647标记山羊抗兔IgG二抗（1∶5000）。最后加入SuperSignal West Pico化学发光底物。进行凝胶图像的密度测定分析使用Image J软件（NIH，Bethesda，MD，美国）。

4.免疫荧光分析：将5组展神经小胶质细胞均进行免疫荧光检测，检测CD11b阳性细胞和Arginse免疫反应细胞的表达情况。将神经组织固定取，将切片在室温中放置2 h，每个切片晾干后，放入洗片盒内，在磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)中洗涤3次，5 min/次。然后放入封片盒中，待水分基本晾干，使用含5%驴血清和0.2%teen-20 PBS封闭，37℃过1 h，然后分别加入鼠抗CD11b 单克隆抗体（1∶200）鉴定小胶质细胞，兔抗Arginase多克隆抗体（1∶100）鉴定小胶质细胞 M2型。4℃过夜后PBS洗涤3次，5 min/次。再加入Dylight 594（1∶400）结合荧光标记的抗小鼠免疫球蛋白 G(immunoglobulin G，IgG)和 Dylight 488（1∶400）结合荧光标记的抗山羊IgG，4℃避光孵育2 h。孵育完毕后使用PBS洗涤3次，5 min/次。使用抗荧光衰减避光封片，使用共聚焦显微镜（FV500-IX71，Olympus，日本）观察并照相。合并面板是叠加图像，显示两重标记的单元格。

四、统计学分析

采用SPSS19.0软件进行统计分析，小胶质细胞M1、M2 型标志分子表达水平用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，5组Arginse/CD11b比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、电针刺激后犬CB1R、CB2R表达

Western blot检测结果显示，B、C组与A组比较，CB1R蛋白的表达量差异均无统计学意义（P＞0.05），而电针刺激处理明显增加了CB2R蛋白的表达量。电针预处理持续15 min连续2周后，C组CB2R的蛋白表达量显著高于A组，差异有统计学意义（P＜0.05），而A组与B组间差异无统计学意义（P＞0.05）。详细信息见图1。

图1 电针刺激后犬大麻素受体表达情况

二、电针与小胶质细胞M2型表达相关性

免疫荧光检测显示，5组小胶质细胞均能检测到CD11b阳性细胞和Arginse免疫反应细胞（图2）。C组经电针治疗后Arginse/CD11b的表达较A组增高（P＜0.05）；而 B、D 组与 A 组比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)，E组经溶剂处理后，Arginse/CD11b的表达较 A 组增高（P＜0.05）（图 3）。

讨 论

图2 5组展神经小胶质细胞M2型免疫荧光检测（×20）

图3 5组Arginse/CD11b细胞的表达水平比较

近年来通过减缓、阻止或逆转神经变性的神经保护策略，促进神经损伤修复在神经退行性病变中的病理作用已成为研究热点。目前，神经退行性疾病的多重致病假说已将焦点转向了其他促成病理因素，特别是神经炎症。神经炎症维持神经退行性改变，形成周期性和自我维持的病理过程，影响细胞因子产生、免疫细胞迁移、抗原表达和病原体清除，一旦小胶质细胞迁移M1表型被激活将会杀死更多的神经元。相关研究认为作为中枢神经系统的免疫吞噬细胞——小胶质细胞已被证实与缺血性脑卒中密切相关，因此抗炎和免疫抑制剂CB2R引起充分的关注[7-9]。在帕金森病患中，前期临床研究瞄准CB1R作为神经保护剂的策略不太成功，一些证据表明CB2R在脑部损伤部位表达增加，CB2R能够刺激细胞因子的释放和免疫细胞的应答，减少抗原呈递，调节免疫活动。有研究表明使用CB2R选择性激动剂0-1996能显著减轻创伤性脑损伤后的脑水肿和小胶质细胞积聚，能够促进受损功能恢复[10]。电针对炎性疼痛及神经损伤的修复作用已得到临床认可，可减少患者痛苦、调节释放促炎性细胞因子或神经营养因子的表达[11]。本研究发现经过电针刺激处理后CB1R蛋白的表达量没有显著变化；而电针刺激持续15 min连续2周后CB2R蛋白的表达量明显增加，且与假手术组比较，CB2R的蛋白表达量显著增高，因此笔者认为CB2R主要参与电针刺激诱导神经损伤保护作用。

有研究进一步对电针与小胶质细胞M2型表达的相关性研究发现，M2型小胶质细胞能诱发一系列的抗氧化反应，抑制缺血后活性氧产生，抑制促炎因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 产生，减少神经元死亡[12,13]。而M2型表面抗原主要表达为Arginase、Ym-1和CD206等，Arginase能预防细胞外基质降解，抑制小胶质细胞迁移，促进功能性突触形成而降低神经元损害[14,15]。本研究检测了电针预处理对展神经损伤后小胶质细胞活化状态的影响，发现电针预处理能够显著升高M2型标志分子Arginase的表达，促使小胶质细胞从M1型向M2型转化。电针预处理能通过内源性大麻素系统诱导展神经修复，笔者选用CB2R拮抗剂AM630影响CB2R的表达，观察其是否对展神经小胶质细胞的活化状态产生影响，发现AM630能拮抗电针对小胶质细胞活化状态的影响。本研究保持了神经鞘膜的完整性，保留了神经电活动的传导连续性，结果表明电针能够减少炎症刺激，起到神经损伤修复保护作用，其机制可能为小胶质细胞M2型被活化介导相关，电针通过CB2R介导调控小胶质细胞M2型表达促进损伤展神经修复。

综上所述，本研究运用Beagle犬展神经损伤模型，通过电针对展神经的刺激，证实电针能够通过CB2R显著升高M2型标志分子Arginase的表达，提示CB2R可能参与电针处理产生展神经保护作用的机制，促进小胶质细胞从M1型向M2型转化，抑制小胶质细胞的活化，延缓展神经损伤，促进修复。