轮状病毒感染后先天性免疫RLRs通路部分关键因子Q-PCR检测方法建立

王苗苗，刘阳阳，闻晓波，冉旭华

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

病原体侵入动物体内，在其复制感染过程中，动物机体中存在多种模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs），来特异识别病原微生物的保守度高的病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patter，PAMPs），主要包括位于细胞表面的膜结合型Toll样受体（Toll like receptors，TLRs）、位于细胞膜的C凝集素受体（C-Lectin receptors，CLRs）、位于细胞质的维甲酸诱导基因I样受体（retinoic acid-inducible gene I（RIG-I）-like receptors，RLRs）等[1-2]，其中维甲酸诱导基因I样受体是识别病毒dsRNA的细胞质传感器[3-4]。迄今为止，已经确定了黑色素瘤分化相关基因5（melanoma differentiation associated gene5， MDA5）、维甲酸诱导基因蛋白Ⅰ（retinoic acid-inducible gene I，RIG-I）、遗传学和生理实验室蛋白2（laboratory of genetics and physiology 2，LGP2）3个RLRs成员[5]。MDA5和RIG-I具有相似的结构，含有两个N末端caspase活化和募集结构域（CARD），中间区段的DExD/H框RNA解旋酶结构域和C末端调节域（CTD）[6]。RIG-I的CARD结构域能够与线粒体抗病毒信号转接蛋白（mitoehondrial antiviral signaling protein，MAVS）相互作用以激活TRAF3、TBK1/IKK-i级联反应，进而磷酸化活化干扰素调节因子3（Interferon regulatory Factor 3，IRF3）[7]，诱导I型干扰素分泌，从而激活宿主先天性免疫应答，对抗病毒感染。IRF3和IRF7是调节IFN和干扰素刺激基因转录的调节因子，在I型IFN的表达和分泌上均发挥重要调节作用。因此，机体被RV感染后，病毒主要被RLRs受体所识别从而引发宿主免疫应答[8]。

轮状病毒（Rotavirus，RV）为非囊膜结构的正二十面体病毒，由包含11个节段的基因组的线性双链RNA组成[9]。该病毒是引起5岁以下婴幼儿严重腹泻的主要病原体之一[10]，发病率高达30%～50%[11]，每年引起约21.5万人死亡[12]，目前尚无特效治疗药，疫苗是重要的预防方式之一。以改良的“琴纳原理”研制的部分减毒RV单价或重配人用疫苗在临床试验中免疫效果却不理想[13-14]，推测可能与宿主先天性免疫应答抑制有关。为监测RV感染后宿主RLRs免疫通路激活情况，本研究以牛RV UK株为研究对象，建立Q-PCR方法检测相关因子转录水平动态变化情况。本试验建立的检测方法具有操作简便、成本较低、准确性高等优点。通过探讨UK株RV对RLRs信号转导通路部分关键因子的影响，为从mRNA水平上研究其与宿主先天性免疫功能关系提供简便方法，也为研究现有疫苗免疫效果不理想的原因奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病毒、细胞及试剂 牛RV UK株、人结肠腺癌细胞Caco-2由本实验室保存；DMEM培养基购自Life公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；EDTA-胰酶购于北京索来宝科技有限公司；TRIzol购自Invitrogen公司；反转录试剂盒购自ThermFisher Scientific公司；SYBR®Premix Ex TaqⅡ购自Takara公司。

1.2 引物设计 参考NCBI GenBank上收录的牛RV UK株VP6、人IRF3、人IRF7、RIG-I、MDA5基因序列，运用DNASTAR和Oligo 7软件设计特异性引物检测各目的基因，引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。引物序列如表1所示。

表1 目的基因实时定量PCR引物Table 1The primer of real time PCR for target genes

1.3 RV UK株感染Caco- 2细胞 取500 μL实验室保存的UK株RV病毒液（MOI=2），加入1 μL胰酶（2.5 μg/μL）37℃孵育30 min，活化病毒。然后接种到Caco-2（人结肠腺癌细胞）细胞中，37℃培养箱放置1 h，期间每隔20 min晃动培养瓶以利于病毒更好吸附于细胞上；弃去病毒液，用无血清DMEM培养基清洗2次以去除未吸附上的病毒；加入含有0.5 μg/mL胰蛋白酶的DMEM培养基，分别培养6、12、24 h后收集细胞。

1.4 RNA的提取 采用TRIzol法提取感染细胞中的总RNA，具体操作按照说明书进行。最终用30～50 μL无核酶水溶解总RNA，-80℃保存备用。

1.5 反转录 取3 μL RNA，1 μL Random Hexamer Primer，8 μL无核酶水于PCR管中混匀，65℃孵育5 min，迅速置于冰上冷却；再加入4 μL 5×buffer，2 μL dNTP（10 mmol/L），1 μL RevertAid RT，1μL RiboLock RNaseInhibitor，42℃2 h，70℃10 min，终止反应，得到cDNA。

1.6 实时定量PCR 以反转录的cDNA为模板，PCR扩增UK株VP6、人IRF3、IRF7、RIG-I、MDA5。优化后反应体系为20 μL：2×SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，无核酶水补足20 μL。以感染RU UK株后6 h样品组为相对对照组，每组设置3个重复。优化后扩增程序为：95℃3 min；95℃10 s，60℃30 s，40个循环；65～95℃获得溶解曲线。

1.7 数据分析 运用SPSS 18.0软件，由2-△△Cq法计算，采用t检验法统计分析感染RV KU株的Caco-2细胞VP6、IRF3、IRF7、RIG-I、MDA5基因转录水平的变化。

2 结果与分析

2.1 RV感染后在细胞中复制能力检测UK株RV感染Caco-2细胞后6 h、12 h、24 h，收集细胞，提取病毒总RNA，反转录得cDNA，采用特异性引物进行Q-PCR，检测UK VP6基因转录水平变化，图1为VP6基因实时定量PCR扩增曲线和温度溶解曲线图，图2为VP6基因转录水平随时间变化情况。由所得数据分析可知，随感染时间延长，VP6基因转录水平逐渐上升，表明UK株RV病毒在Caco-2细胞中不断复制扩增。

图1 VP6实时定量PCR扩增曲线及温度溶解曲线Fig.1The Amplification and melt curve of VP6 of Real-time PCR

图 2VP6平均相对含量变化Fig.2The average relative content of UK rotavirus VP6

2.2 RLRs免疫通路关键因子转录水平监测UK株RV感染Caco-2细胞后6 h、12 h、24 h，收集细胞，提取RNA，反转录得cDNA，采用特异性引物进行Q-PCR，检测RIG-I、MDA5、IRF3、IRF7基因转录水平变化，图3为各基因实时定量PCR扩增曲线及溶解曲线图，图4为各基因转录水平随时间变化情况。由数据分析可知，在感染6～24 h后，IRF3和IRF7基因转录水平显著上升；感染后6～12 h，RIG-I和MDA5基因转录水平明显上升，12～24 h则变化不明显。

3 讨论

轮状病毒为人兽共患的病原体，会引起婴幼儿和多种幼龄动物的肠道疾病，危害严重，但RV导致机体腹泻的具体机制尚未清楚，因此开发切实有效的疫苗来预防此病是当前首要任务。当前世界上有Merck公司开发的五价人-牛重配疫苗RotaTeq®目前在非洲、中美洲和亚洲某些国家等地所进行的临床试验数据表明：在某些地区的疫苗效力尚不足50%[15-16]，Rotarix®疫苗也有类似现象[17-18]，且有研究表明，Rotarix®和RotaTeq®可能会增加婴幼儿肠套叠的风险[19]，推测可能与宿主先天性免疫应答反应有关。尽管近些年对RV的研究在逐渐增多，但对于RV的发病机制及其在感染机体后机体产生的免疫应答过程尚不清楚。

图 3 IRF3、IRF7、RIG-I和MDA5 mRNA实时定量PCR扩增曲线和溶解曲线Fig.3 The Amplification and melt curve of IRF3,IRF7,RIG-I and MDA5 of Real-time PCR

图 4 IRF3、IRF7、RIG-I和MDA5平均相对含量变化Fig.4 The average relative content of IRF3,IRF7,RIG-I and MDA5

本试验以UK株RV为研究对象，选用易于其增殖复制的人结肠腺癌细胞，其感染人源细胞Caco-2后6～24 h复制不断增加，表明其在宿主细胞内复制能力未受到明显抑制。Mario等[20]将RV野生型毒株UK、SA11-4F、SA11-30-19和NSP1基因缺陷型毒株brvA、SA11-5S、SA11-30-1A分别感染恒河猴肾细胞MA104，发现野生型和NSP1基因缺陷型在MA104细胞上复制能力相当；而感染猴肺细胞FRhL2和人结肠细胞Caco-2，发现野生型RV复制能力明显比NSP1基因缺陷型强，表明这几个毒株感染MA104细胞后可能未激活细胞的免疫应答或较弱的免疫应答，而感染FRhL2和Caco-2后则可能激活细胞较强的免疫反应，该发现为减毒RV活疫苗的研发提供思路。RLRs是宿主识别病毒双链RNA的重要细胞质模式识别受体，能够最终促进I型IFN的分泌，激活宿主先天性免疫应答，对抗病毒感染。有研究表明RV感染后对RLRs信号通路具有抑制作用[21]。本研究通过建立QPCR方法，监测RLRs信号通路关键因子RIG-I、MDA5、IRF3和IRF7在RV感染后各基因转录水平变化，结果表明，UK株RV感染后早期（6～12 h）被细胞质模式识别受体RLRs所识别，活化下游信号分子，激活宿主先天性免疫应答，各关键因子表达量均上调，之后在感染后12～24 h，MDA5及RIG-I转录水平没有明显变化，可能由于RV不断复制产生的拮抗宿主免疫的蛋白发挥作用，逃避了RLRs的识别，抑制了宿主免疫应答，模式识别受体转录水平变化不明显。该方法可为RV感染宿主细胞后监测RLRs信号通路激活情况、先天性免疫应答情况提供数据支持。