3种芳香植物精油对竹材防霉作用初探

王安可，毕毓芳，王玉魁，温 星，李景鹏

(1.国家林业局竹子研究开发中心，浙江 杭州 310012； 2.浙江省竹子高效加工重点实验室，浙江 杭州 310012)

竹材在人们生活中应用非常广泛，除了凭借其外表独特和纹理通直等特点被大量加工成竹地板和竹家具外，还被用于制造竹案板、筷子、牙签、乐器和工艺美术品等[1]。但竹材有一个限制其应用价值的特点——不易腐，但易霉变[2]。目前现有的主要防霉技术有物理和化学2种方法。物理方法为烟熏、蒸煮及高温热处理等；化学方法为使用有机碘化物、三唑化合物、硼化物和铜基类防霉剂[3]。众所周知，物理方法不能有效的防止竹材霉变，虽然这些常用的化学防霉剂添加技术可以在很大程度上抑制竹材的霉变，但是由于化学药剂的毒性较大，因此限制了其在家居生活领域的应用。随着人们生活水平提高、生活模式与消费观念的改变，开发更加环保有效的防霉技术也变的极为迫切。

植物精油是一类从植物中萃取的芳香味油状液体，是一类优良的天然抗菌材料。作为抗菌材料，植物精油具有以下优点：(1)具有广谱高效的抗菌活性[4]；(2)具有熏蒸特性、气味芳香；(3)取自天然植物，绿色环保；(4)来源广，提取容易。竹材是一种多孔结构的材料并且纵向渗透性良好，这一特性使得其可作为精油缓释的优良载体。此外，植物精油因其多种优点在抗菌领域具有巨大的潜在应用价值[5-6]，若能有效抑制霉菌生长，在作为环保型竹材防霉剂的同时还可净化环境空气，舒缓情绪等。甚至可以根据精油特征，开发新型的竹材产品，进一步提高竹产品的附加值。

本研究选用生活中最常见的3种植物精油——杂熏衣草(Lavandulaangustifolia×latifolia)、茶树(又称白千层，Melaleucaalternifolia)和蓝胶尤加利(又称蓝桉，Eucalyptusglobules)精油，初步研究其对3种常见竹材霉菌——黑曲霉(Aspergillusniger)、桔青霉(Penicillamcitrinum)和哈茨木霉(Trichogermaharzianum)的抗菌作用；并评估3种精油对竹材霉菌的防治效力。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验中所用的精油均采购自莉微儿(深圳)贸易有限公司；其中熏衣草精油原料为为法国杂薰衣草，茶树精油原料为澳洲互叶白千层，蓝胶尤加利精油原料为澳洲蓝胶尤加利。所用菌种黑曲霉、桔青霉和哈茨木霉以及马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基均购自北京北纳创联生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1精油有效成分的测定 按照国家标准《GB/T 12653-2008 中国熏衣草(精)油》、《GB/T 1886.270-2016食品安全国家标准 食品添加剂 茶树油(又名互叶白千层油)》、《GB/T 1886.33-2015食品安全国家标准 食品添加剂 桉叶油(蓝桉油)》中规定的检测程序设定，通过GC-MS检测3种精油的有效成分；并按照国家标准《GB/T 11538-2006 精油 毛细管柱气相色谱分析 通用法》中所述的面积归一化法计算主要成分含量。

1.2.2霉菌悬浮液的制备 将黑曲霉、桔青霉和哈茨木霉接种在含PDA培养基的90 mm培养皿中，温度28℃、湿度80%±5%、暗培养7 d。将培养基表面的菌丝转移到已灭菌的研钵中，加少许无菌生理盐水研磨至无块状，后使用无菌棉球过滤，制备成悬浊液。使用血球计数板计数，用无菌生理盐水将各菌悬浮液稀释到终浓度为1×106个·mL-1，4 ℃保存备用。

1.2.3精油抗霉菌性检测——牛津杯法 在90 mm培养皿中加入15 mL 2%的无菌琼脂溶液，凝固后再加入20 mL已灭菌的PDA培养基。在每个制备好的平板中加入霉菌悬浮液200 μL，每种菌12个平板。在每个平板的中央插入一个无菌的牛津杯，每个牛津杯中加入精油150 μL。3个菌种与3种精油交叉处理，以未添加精油的平板为空白对照(CK)，重复3次，28 ℃暗培养10 d。拍照记录结果。

1.2.4精油对竹材霉菌防治效力试验 该项试验方法基本参照国家标准《GB/T 18261-2013 防霉剂对木材霉菌及变色菌防治效力的实验方法》中关于实验室内竹材霉菌试验的规定。本试验只使用混菌法(1.2.2中的3种霉菌悬浮液等比例混合)对精油的防霉效力进行研究。

2 结果

2.1 精油的有效成分

通过GC/MS测得的精油化学组分见表1。结果显示，薰衣草油的主要成分是芳樟醇(41.94%)、邻氨基苯甲酸芳樟酯(31.66%)、樟脑(7.60%)，1，8-桉叶素(6.97%)、β-蒎烯(4.45%)和乙酸熏衣草酯(3.06%)；茶树油的主要成分是松油烯-4-醇(53.06%)、γ-松油烯(20.45%)、P-伞花烃(10.23%)、异松油烯(9.36%)、α-松油烯(4.34%)和1，8-桉叶素(2.56%)；尤加利油的主要成分是1，8-桉叶素(72.58%)、P-伞花烃(15.95%)、苧烯(5.98%)和(-)-β-蒎烯(5.48%)。

表1 精油的特征组分含量Tab.1 Chemical components of essential oils

图1 熏衣草、茶树和尤加利精油对霉菌的抑菌结果Fig.1 Anti-mildew effects of Lavandula angustifolia,Melaleuca alternifolia and Eucalyptus globules essential oil

注：左上为未处理的竹材试件(CK)，右上为熏衣草精油处理的竹材试件，左下为尤加利精油处理的竹材试件，右下为茶树精油处理的竹材试件。PS：Upleft is bamboo timbers without treatment (CK), upright is bamboo timbers with lavender oil treatment, downleft is bamboo timbers with eucalypt oil treatment and downright is bamboo timbers with tea tree oil treatment.图2 精油对竹材的防霉效果Fig.2 Mouldproof effect of essential oils on bamboo

2.2 精油对霉菌的抑菌作用

为了研究熏衣草、茶树和尤加利精油的抗霉菌性能，该试验使用牛津杯抑菌圈法对黑曲霉、桔青霉和哈茨木霉进行测试。图1中茶树精油的3个处理都产生了明显的抑菌圈，熏衣草精油对哈茨木霉的处理有明显的抑菌圈，尤加利精油对桔青霉的处理有非常小的抑菌圈；其它处理均未见明显抑菌圈。但是所有精油处理的平板与对照(CK)相比，菌的长势都有非常明显的减弱，说明3种供试精油对3种所试霉菌都有不同程度的抑制作用。

总体上，以精油为单位以菌的生长量作为衡量标准，图中可以明显看出对霉菌的抑菌效果从强到弱依次是茶树>熏衣草>尤加利。但以单个菌种来说，抑菌效果的强弱有所不同。对黑曲霉的抑菌能力依次是茶树>熏衣草>尤加利；其中茶树与熏衣草的抑菌能力相差不大，几乎黑曲霉的菌丝体和孢子都不能正常生长，只在平板中可见非常微弱的孢子初期萌发状态；但是尤加利对黑曲霉的抑制作用非常微弱，在平板中可见菌体生长非常旺盛，但仍弱于CK。对桔青霉的抑菌能力依次是茶树>尤加利>熏衣草，抑菌圈明显为从大到小到无。对哈茨木霉的抑菌能力依次是熏衣草>茶树>尤加利；熏衣草对哈茨木霉的抗性较强，可见非常明显的抑菌圈，并且周围菌的长势非常微弱；茶树处理可见明显抑菌圈，但周围仍见明显白色菌丝；尤加利处理不仅没有抑菌圈，平板中菌丝生长明显，但与CK相比长势较弱。

2.3 精油对竹材霉菌防治效力

根据国标中的规定，在4周后观察竹材试件表面的霉变面积(图2)。在图中可以清晰的看到，未经处理的竹材试件(CK)感染面积为全部，感染值分级为4；经过薰衣草、尤加利和茶树精油处理的试件全部没有被感染，感染值分级为0。该试验结果说明试验中所使用的薰衣草、尤加利和茶树精油可以有效的防止竹材霉变。

此外，观察试件下方的菌丝生长可以发现，放置了精油处理试样的平板，培养基表面的霉菌数量远远少于CK。并且精油试件正下方的霉菌也比平板边缘少，尤其是尤加利和茶树精油试件的下方，霉菌几乎无法生长。这说明，精油挥发出的气态物质可以抑制霉菌生长，并且可能蒸汽浓度越大抑菌效果越好。

3 分析与讨论

3.1 精油有效成分分析

由于植物受品种、种植地环境和栽培方式等因素的影响，蒸馏得到的精油组分会产生比较大的差别。目前许多国家对常见的植物精油制定了标准，对精油的一些特性作出了规定，以便评估其质量。表2为我国对产自中国的熏衣草、茶树和桉树油的特征组分给出的标准。表3为国际(ISO)上对熏衣草(真实熏衣草[7](LavandulaangustifoliaMill.)、杂熏衣草[8](LavandulaangustifoliaMiller×latifoliaMedikus))、茶树[9]和兰桉[10]油的特征组分给出的标准。

表2 精油中国国家标准规定的特征组分Tab.2 GB standard components of essential oils

表3 精油国际标准规定的特征组分Tab.3 ISO standard components of essential oils

注：tr.指痕量
PS：The tr. means trace.

3.1.1熏衣草精油的主要有效成分分析 目前薰衣草的种类主要有狭叶薰衣草(True lavender，LavandulaangustifoliaMill，又称真薰衣草)和宽叶薰衣草(Spike lavender，LavandulalatifoliaL.)。真熏衣草和杂熏衣草(狭叶和宽叶的自然杂交品种)是法国西南部(市场主流)传统种植的精油生产品种。

但不论是ISO还是国标(GB)，特征成分中都没有涉及邻氨基苯甲酸芳樟酯(这一成分是本研究所用熏衣草精油的主要成分)，而标准中规定含量较大的乙酸芳樟酯却在所试精油中没有发现。虽然这一结果与现行标准相悖，但也并不是个例。采购自英国Aroma Trading Ltd.的真熏衣草(L.angustifolia)精油，其有效成分是芳樟醇34.5%和邻氨基苯甲酸芳樟酯38.4%[11]。波兰种植的5种熏衣草(L.angustifoliaL.)其精油的主要成分为芳樟醇23.9%～15.8%、邻氨基苯甲酸芳樟酯12.3%～16%。种植在罗马尼亚西部的L.angustifoliaL.精油的主要成分也是芳樟醇和邻氨基苯甲酸芳樟酯[12]。Bayoub[13]还发现L.officinalisL.是以邻氨基苯甲酸芳樟酯作为最主要的组分的(46.3%)。并且巧合的是含有大量邻氨基苯甲酸芳樟酯的熏衣草精油，其中都不含有乙酸芳樟酯。结合本研究中的结果，笔者猜测本研究使用的杂熏衣草原料可能是L.angustifoliaL.与L.latifolia杂交的品种而不是主流L.angustifoliaMiller。

根据前人的研究，可以肯定的是国标中规定的主要特征组分乙酸芳樟酯和芳樟醇[14-16]均有有效的抗菌性能[17]，且二者之间没有协同作用[18]。目前还没有关于邻氨基苯甲酸芳樟酯抗菌能力的报道，所以关于其是否为有效的抗菌组分还有待研究。

3.1.2茶树精油的主要有效成分分析 市面上大多数的茶树油原料为互叶白千层(Melaleucaalternifolia)，但包鳞白千层(M.bracteata)、白油树(M.quinquenervia)、石南叶白千层(M.ericifolia)、绿花白千层(M.viridiflora)、白千层(M.leucadendron)散花白千层(M.dissiliflora)和轮叶白千层(M.linariifolia)等也可以作为白千层油的原料[19]。由于种植混乱和原料价格等问题，许多茶树油的品质不稳定，同一批次的茶树油可能混杂了不同种的白千层原料。茶树油的成分种类大体相同，但根据主成分的不同可分为不同的化学类型(不依赖植物学分类)，如松油烯-4-醇型、γ-松油烯型、桉叶素型、桉叶素-异松油烯型、桉叶素-松油烯-4-醇型等[20]；这些类型的不同与引种地和栽培环境有密切的关系[21]。本研究中使用的为松油烯-4-醇型白千层油，所含主要组分基本符合国际和国内标准。

Terzi[22]对茶树油和其主要组分松油烯-4-醇、γ-松油烯、1，8-桉叶素的抗菌性进行对比，发现这3种组分对Fusariumculmorum、Pyrenophoragraminea和Fusariumgraminearum均有抑制作用，其中松油烯-4-醇型尤为突出。Mondello[23]在对茶树油及其成分松油烯-4-醇和1，8-桉叶素的抗菌(Candidaspp.)性比对时发现，松油烯-4-醇具有极强的抑菌功能，但1，8-桉叶素在所试浓度(4%)内没有发现有抑菌效果。由此，可以肯定的是松油烯-4-醇是茶树油抗菌的主要活性成分。

3.1.3尤加利精油的主要有效成分分析 虽然桉(澳洲产区的多称为尤加利)属的品种较多，但所产精油的主成分均为1，8-桉叶素。这一点从有关的标准中可以证实，国标中规定桉属精油中1，8-桉叶素含量需≥80%(表2)，ISO规定其含量需≥60%(表3)才能认定为合格的桉树精油。

但另研究者意外的是，作为桉属精油主要成分的1，8-桉叶素并不是非常有效的抑菌活性成分，在大多数研究中都被证实没有抑菌活性。Vilela[24]比较了尤加利精油和1，8-桉叶素对曲霉属的黄曲霉(A.flavusLink)和寄生曲霉(A.parasiticusSpeare)的抑菌活性，结果发现2.5%的精油添加，几乎可以完全抑制黄曲霉和寄生曲霉的生长，但是1，8-桉叶素并不会抑制这2种菌的生长。SafaeiGhomi[25]也证实1，8-桉叶素对黑曲霉没有抑制作用，但含有该成分的E.largiflorens对黑曲霉有抑菌活性。

虽然除了1，8-桉叶素外，桉树精油还含有其它一些物质，如对伞花烃和α-蒎烯等。其中据研究对伞花烃对念珠菌属(Candidaspp.)有有效的抑制作用[26]，但是对Alternariaspp.、Fusariumspp.、Pythiumultimum和Phytophthoracapsici等真菌完全没有抑制作用[27]。Filipowicz[28]发现对伞花烃和正反式α/β蒎烯对Candidaalbicans和一些细菌有抗菌作用。所以尤加利的抗菌可能是含量并不多的伞花烃和蒎烯等物质引起的。

3.2 精油的防霉作用

3.2.1薰衣草精油的防霉作用 根据2.2和2.3的结果，可以肯定所试薰衣草精油对竹材致霉菌黑曲霉、桔青霉和哈茨木霉有抑制作用。但不能肯定所有的薰衣草精油均能很好的防止竹材霉变，因为有研究者在对同属真菌进行试验时，得出过不同的结果。如Císarová[29]发现添加0.625 μL·cm-3的熏衣草(L.angustifoliaMiller)精油可以完全抑制曲霉属(Aspergillu)的黑曲霉和塔宾曲霉(A.tubingensis)的生长。Angioni[30]发现意大利薰衣草(LavandulastoechasL. ssp.stoechas)对曲霉属的黄曲霉(A.flavus)有较弱的抑制所用(抑菌率17.6%～23.1%)。但Daferera[31]却发现纯薰衣草(L.angustifoliaMiller)精油对青霉菌(Penicilliumdigitatum)几乎没有抑制作用。

这些不同的结果有可能是由于精油的不同施用方法造成的。Inouye[32-33]有趣的发现薰衣草(作者没有指出所用薰衣草的具体的拉丁名，只指出产自日本北海道)精油蒸汽可以抑制烟曲霉(Aspergillusfumigatus)的生长，但是液态的精油却无法抑制其生长，当移除薰衣草精油的蒸汽后，菌丝恢复生长。他还指出，薰衣草蒸汽会导致分生孢子发育不完全，这种抑制作用可能是抑制了真菌的呼吸作用而不是直接抑制其生长。在本研究中，笔者使用了牛津杯法和国标防霉法。牛津杯法中，由于牛津杯下边缘直接深入培养基，上边缘几乎与培养基上盖相接，所以笔者认为牛津杯法的抑菌途径应为液体接触为主，气态挥发为辅；而国标法中，试件所吸收的精油并没有直接接触到霉菌本身，笔者认为抑菌途径为气态。结果也发现国标法的抑菌效果极为显著，这也从另一方面印证了Inouye提出的薰衣草精油蒸汽对曲霉菌的抑制作用更为明显。同时也不排除该试验所用的2种方法都可能是精油通过挥发气态物质而非直接接触产生抑菌效果。

此外，这些不同的结果很有可能是薰衣草在产地和品种上的差异造成的。不同种植地的薰衣草精油在有效成分含量上差异非常大，例如保加利亚产的薰衣草精油含51.9%的芳樟醇和9.5%的乙酸芳樟酯，法国产的含29.1%的芳樟醇和43.2%的乙酸芳樟酯。并且二者在对黑曲霉和赭曲霉(Aspergillusochraceus)的抗性上有一定区别[34]。

3.2.2尤加利精油的防霉作用 根据2.2中的结果，本研究中尤加利精油在牛津杯法这一试验中对黑曲霉的抑制作用较为微弱，对哈茨木霉的抑菌效果也弱于其它2种精油。这一结果与许多前人的研究结果基本一致。苏裕昌[35]等对4种桉叶(垂尾桉(Eucalyptusurophylla)、玫瑰桉(E.grandis)、赤桉(E.camaldulensis)及柠檬桉(E.citriodora))精油的抗真菌活性进行检测，发现4种桉树精油对棒曲霉(Aspergillusclavatu)、黑曲霉、桔青霉和绿色木霉(Trichodermaviride)在施用前期(7 d)都有非常明显的抑制作用，但随着时间的延长，抑菌效率会大大降低。尤其是4种桉树对绿色木霉，以及垂尾桉和赤桉对棒曲霉、黑曲霉，柠檬桉对黑曲霉的抑菌活性在21 d时完全失效。Katooli[36]也发现赤桉(E.camaldulensisDehnh.)精油只在初期(3 d)对青霉菌和黄曲霉菌有抑制作用，在30 d时菌丝的生长与对照无差异。Císarová[29]发现添加0.625 μL·cm-3的尤加利(E.globulusLabill.)精油对黑曲霉和塔宾曲霉的抑制作用非常微弱。Safaeighomi[25]用Eucalyptuslargiflorens和Eucalyptusintertexta精油对黑曲霉进行抑菌试验，发现只有E.largiflorens对黑曲霉有抑菌活性。

上述研究都表明，桉属精油在对霉菌的长期抗菌作用中效果不佳。但本研究的结果却发现蓝胶尤加利精油对竹材防霉的效用非常明显。这可能是由于：(1)处理竹材中含有大量的尤加利精油，4周的时间内不会被完全的挥发，较高的精油浓度保证了抑菌效果；(2)尤加利精油的种类较多，对霉菌的抑菌效果与所用精油的原料品种有关；(3)与薰衣草精油类似，气态的尤加利精油更能发挥其抑菌效果(这一猜想更能解释在2.3中的结果，含尤加利精油的竹材试样下方菌丝几乎无法生长)。

3.2.3茶树精油的防霉作用 不论是牛津杯法还是国标法，茶树精油都表现出卓越的抑菌性能。这一结果与前人的研究也相符合。Hammer[37]发现茶树精油对黑曲霉、黄曲霉、烟曲霉和青霉菌(Penicilliumspp.)都有非常高的抑菌活性。Carson[38]对黑曲霉、烟曲霉、黄曲霉和青霉的试验也获得同样的结果。Bishop[39]也证实茶树油可以有效抑制黄曲霉的生长。

此外，Cox[40]经过实验发现，茶树油可以抑制细菌和真菌的呼吸作用，并且可以增加细菌细胞质膜和真菌原生质膜的渗透性；他提出茶树油的抑菌原理可能是茶树油中的萜类物质破坏细胞膜，使细胞内的物质渗出，从而破坏其生长。Shao[41]也提出，真菌在接触茶树油后其细胞壁首先被破坏，紧接着生物质膜的脂肪酸类型发生改变，这些变化直接导致细胞内的物质渗出，从而死亡。

4 总结及存在的问题

本研究选用的杂熏衣草、茶树和蓝胶尤加利精油对竹材防霉有良好的效果。根据研究结果及前人研究推测，精油中有效的抑菌活性成分可能是芳樟醇、松油烯-4-醇、伞花烃(含异构体)和蒎烯(含异构体)。此外，气态的精油对黑曲霉、桔青霉和哈茨木霉的抑菌效果可能要强于液态的效果。

虽然研究证实杂熏衣草、茶树和蓝胶尤加利精油对黑曲霉、桔青霉和哈茨木霉的抑菌作用非常有效，但有以下几个问题没有解决：(1)精油容易挥发，当竹材中的精油完全挥发殆尽时，霉菌是否会恢复生长。(2)如果确认气态的精油具有更强的防霉作用，如何解决施用技术的问题。(3)因为精油为天然提取物，每一批次的产品在主要物质组成上都有一定的差异，如何保证其使用效果。(4)是否能根据精油的有效活性抑菌成分，研制更加经济有效的复合型防霉剂。