24种竹笋蛋白对肿瘤细胞增殖的抑制作用

杨慧敏，吴良如

(1.国家林业局竹子研究开发中心，浙江 杭州 310012；2.浙江省竹子高效加工重点实验室，浙江 杭州 310012)

近年来从植物中发现了越来越多具有较好抗癌活性的蛋白或小分子多肽，已成为药物研发中的一个活跃领域。随着分离技术和结构鉴定等研究方法的飞速发展，越来越多的具有某种生物活性及药用价值的天然多肽类化合物被鉴定出来[1-2]。付芸等[3]从天南星科植物半夏(Pinelliaternata)块茎鲜汁中分离纯化的植物蛋白，可明显抑制Bel-7402 细胞生长的同时可促进Bel-7402细胞凋亡。此外，研究发现半夏提取物也能诱导宫颈癌细胞SNU-17的细胞凋亡[4]。邓乾春等[5]从白果中提取分离得到的白果清蛋白，能抑制体内S180实体瘤和体外S180细胞的生长，并具有清除·OH和O2·的能力。薛照辉等[6]发现酶酶解的菜籽清蛋白作用于小鼠体内，能明显抑制小鼠体内肉瘤的生长，同时可提高小鼠自身免疫能力。

竹笋在我国具有悠久的药用和保健历史[7-8]。中医认为，竹笋性味甘寒、入肺胃经，有清热化痰、解毒透瘆、和中润肠的功效，适用于热毒痰火内盛、胃热嘈杂、口干便秘、咳嗽痰多、食积不化、脘腹胀满等病症[9]。Fujimura等[10]从毛竹笋中分离出2种具有抗致病菌和抗真菌功能的多肽Pp-AMP1和Pp-AMP2，通过分析其氨基酸序列发现其与槲寄生毒肽(viscotoxin)有大约70%的同源性，与硫堇蛋白有40%左右的同源性。槲寄生毒肽对多种肿瘤细胞系，如人肺癌细胞、人宫颈癌细胞、人脑瘤细胞等，具有细胞毒活性，对恶性肿瘤细胞有抑制作用，还有免疫调节作用，能预防肿瘤的生长。Wang等[11]从麻竹笋中得到分子量为20 kDa的抗真菌蛋白Dendrocin，它能抑制菌丝体的生长，经分析N端序列发现其与类甜蛋白相似，但分子量更小些，且这种蛋白不像其他抗菌蛋白一样具有红细胞凝集和核糖核酸酶活性；Maekawa等[12]从竹笋中分离到3个与酪蛋白激酶II相关的60S酸性核糖体P蛋白(13 kDa，15 kDa和35 kDa)具有很强的体内磷酸化抑制作用。从这些为数不多的研究中，我们可以惊喜地发现从竹笋资源中寻找具生理活性的功能蛋白或活性多肽将具有非常大的潜力和无限的可能性。基于此，本研究对不同种属的24种竹笋蛋白对胃癌细胞株SGC7901和结肠癌细胞株HCT116增殖的影响进行研究，探究不同浓度的竹笋蛋白对SGC7901和HCT116细胞增殖的影响，试图从中筛选出影响癌细胞增殖活性的竹笋蛋白，为抗癌新药的研究提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人胃癌细胞株SGC7901和人结肠癌细胞株HCT116均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(http：//www.cellbank.org.cn/)；胎牛血清(货号：SH30396.03)和RPMI-1640培养基(SH30809.01)均购自Hyclone公司；CCK-8细胞增殖活性检测试剂盒(货号KGA312)；植物蛋白提取试剂盒(货号：KGP7100)和青链霉素混合液(货号：KGY0023)均购自上海锐赛生物技术股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养 复苏胃癌细胞株SGC7901和结肠癌细胞株HCT116，采用RPMI1640培养基(10% FBS+1%青霉素-链霉素混合液)接种至细胞培养瓶，并置于37 ℃，5%二氧化碳培养箱培养至对数生长期备用。

1.2.2竹笋蛋白提取 称取100～200 mg竹笋，置于液氮中过夜，在液氮环境中样本至粉碎。加入1 mL Lysis Buffer工作液[每mL Lysis Buffer加入1 μL蛋白酶抑制剂，10 μL DTT和10 μL PMSF(100 mM)]，4 ℃孵育30 min，每10 min涡旋混匀一次。完全裂解后(无明显沉淀)， 4 ℃，14 000 rpm离心10 min，收集上清即为蛋白提取物。BCA法测定蛋白液浓度，并分装保存于-70 ℃。

1.2.3竹笋蛋白孵育胃癌细胞株SGC7901和结肠癌细胞株HCT116 实验前一天，分别将胃癌细胞株SGC7901和结肠癌细胞株HCT116细胞计数，按3.5×103·孔-1接种于96孔板，37 ℃，5%二氧化碳培养箱培养，细胞密度长至60%～70%时将竹笋蛋白按0.02 mg·mL-1与培养基一起作用于上述细胞，72 h后倒置显微镜拍照，记录细胞生长状况。

1.2.4细胞增殖活性检测-CCK-8法 细胞用竹笋蛋白(实验前将竹笋蛋白用完全培养基按1∶50、1∶100、1∶200、1∶300、1∶400和1∶500的比例稀释)处理72 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，混匀后培养箱培养1.5 h，酶标仪测OD450 nm的吸光度值，按照以下公式计算细胞增殖抑制率：

抑制率% =(1-加药OD值/阴性对照OD值)×100%

1.2.5IC50值(半抑制浓度)的计算 采用GraphPad Prism 软件，根据上述各增殖抑制率，计算其IC50值。

1.2.6统计学分析 所有实验数据均采用SPSS v21.0(http：//spss.en.softonic.com/)统计学分析软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示。采用Student′st-检验进行两样本均数差异显著性分析，*P<0.05定义为显著性差异，**P<0.01定义为极显著性差异。

2 结果

2.1 备选24种竹子基本信息

为了探讨不同新鲜竹笋蛋白对胃癌细胞株SGC7901和结肠癌细胞株HCT116增殖的影响，我们选取了24种竹子进行相关研究，详细种属信息如表1所示。

表1 24株备选竹子的基本信息汇总Tab.1 Basic information on 24 Bamboo species under study

2.2 不同浓度竹笋蛋白对胃癌细胞株SGC7901细胞增殖的抑制作用

将不同浓度竹笋蛋白作用于胃癌细胞SGC7901，72 h后，CCK-8法检测细胞增殖情况，结果如图2所示，奉化水竹、黄古竹、油苦竹、黄纹竹、少穗竹和黄竿乌哺鸡竹的竹笋蛋白浓度与细胞增殖抑制率成正比，随浓度的增加细胞增殖抑制率越明显。此外，对于多数竹笋蛋白，低浓度处理细胞时，随蛋白浓度的增加细胞增殖抑制率降低，但是高浓度处理时，浓度越高，细胞增殖抑制率也越高。24种竹笋蛋白均可抑制SGC7901细胞增殖，在一定浓度范围内，浓度越高抑制作用越明显。

图1 不同浓度蛋白对胃癌细胞株SGC7901细胞增殖的影响Fig.1 The effects of bamboo shoot protein with different concentrations on the proliferation of SGC7901 cells(A1-F1分别表示紫竹、花毛竹、橄榄竹、黄曲竿竹、曲竿竹、金明竹；A2-F2分别表示短穗竹、黄古竹、角竹、篌竹、奉化水竹、水竹；A3-F3分别表示黄纹竹、富阳乌哺鸡竹、花哺鸡竹、寿竹、水竹、毛竹；A4-F4分别表示紫蒲头灰竹、白哺鸡竹、甜笋竹、油苦竹、少穗竹、黄竿乌哺鸡竹)

2.3 不同浓度竹笋蛋白对结肠癌细胞株HCT116细胞增殖的抑制作用

将不同浓度竹笋蛋白作用于结肠癌细胞株HCT116，72 h后CCK-8法检测细胞增殖情况，结果如图3所示，花毛竹、黄曲竿竹、奉化水竹、木竹、紫蒲头灰竹、黄纹竹、寿竹、白哺鸡竹、黄古竹、少穗竹和黄竿乌哺鸡竹的竹笋蛋白浓度与细胞增殖抑制率成正比。对于橄榄竹、金明竹、短穗竹、角竹、花哺鸡竹和毛竹，低浓度处理细胞时，随蛋白浓度的增加细胞增殖抑制率降低，但是高浓度处理时，浓度越高，细胞增殖抑制率也越高。对于其他竹笋蛋白，不同浓度作用于细胞时，细胞增殖抑制率不规律，但仍可以抑制细胞增殖。结果显示24种竹笋蛋白中，多数竹笋蛋白可抑制结肠癌细胞株HCT116的增殖，在一定浓度范围内，浓度越高抑制作用越明显。

图2 不同浓度蛋白对结肠癌细胞株HCT116增殖的影响Fig.2 The effects of bamboo shoot protein with different concentrations on the proliferation of HCT116 cells(A1-F1分别表示紫竹、花毛竹、橄榄竹、黄曲竿竹、曲竿竹、金明竹；A2-F2分别表示短穗竹、黄古竹、角竹、篌竹、奉化水竹、水竹；A3-F3分别表示黄纹竹、富阳乌哺鸡竹、花哺鸡竹、寿竹、水竹、毛竹；A4-F4分别表示紫蒲头灰竹、白哺鸡竹、甜笋竹、油苦竹、少穗竹、黄竿乌哺鸡竹)

2.4 24种竹笋蛋白对胃癌细胞株SGC7901和结肠癌细胞株HCT116增殖活性的影响

在一定浓度范围内，不同竹笋蛋白均可抑制SGC7901和HCT116细胞增殖。为进一步验证这种抑制作用，我们将提取的24种稀释成不同浓度的竹笋蛋白作用于SGC7901和HCT116细胞株72 h后，采用光学显微镜观察细胞的生长情况，加以验证其对肿瘤株细胞增殖活性的影响。

例如，图3为24种提取的竹笋蛋白原液稀释50倍后作用于胃癌细胞株SGC7901，培养72 h后显微镜下的细胞生长情况。从图中我们可以明显地看到，与对照组相比，24种竹笋蛋白作用于胃癌细胞株SGC7901后，细胞数明显的少于对照组，尤其是橄榄竹(图3-D1)、角竹(图3-A2)、曲竿竹(图3-C3)、短穗竹(图3-E3)、白哺鸡竹(图3-A5)以及少穗竹(图3-D5)组细胞数最少，说明24种提取竹笋蛋白原液稀释50倍后均可抑制胃癌细胞株SGC7901的增殖。

图3 24种竹笋蛋白对胃癌细胞株SGC7901增殖的影响Fig.3 The effects of proteins of 24 species of bamboo shoots on the proliferation of SGC7901 cells(A1-E1分别表示对照组、紫竹、花毛竹、橄榄竹、黄曲竿竹；A2-E2分别表示角竹、篌竹、奉化水竹、水竹、木竹；A3-E3分别表示毛竹、紫蒲头灰竹、曲竿竹、金明竹、短穗竹；A4-E4分别表示黄古竹、黄纹竹、富阳乌哺鸡竹、花哺鸡竹、寿竹；A5-E5分表表示白哺鸡竹、甜笋竹、油苦竹、少穗竹、黄竿乌哺鸡竹)

图4为24种提取的竹笋蛋白原液稀释50倍后作用于结肠癌细胞株HCT116，培养72 h后显微镜下的细胞生长情况。与对照组相比，24种竹笋蛋白作用结肠癌细胞株HCT116后，细胞数明显的少于对照组，尤其是橄榄竹(图4-D1)、奉化水竹(图4-C2)、曲竿竹(图4-C3)、黄古竹(图4-A4)、甜笋竹(图4-B2)、少穗竹(图4-D5)以及黄竿乌哺鸡竹(图4-E5)作用组细胞数最少，说明24种提取的竹笋蛋白原液稀释50倍后均可抑制结肠癌细胞株HCT116的增殖。

图4 24种竹笋蛋白对结肠癌细胞株HCT116增殖的影响Fig.4 The effects of proteins of 24 species of bamboo shoots on the proliferation of HCT116 cells(A1-E1分别表示对照组、紫竹、花毛竹、橄榄竹、黄曲竿竹；A2-E2分别表示角竹、篌竹、奉化水竹、水竹、木竹；A3-E3分别表示毛竹、紫蒲头灰竹、曲竿竹、金明竹、短穗竹；A4-E4分别表示黄古竹、黄纹竹、富阳乌哺鸡竹、花哺鸡竹、寿竹；A5-E5分表表示白哺鸡竹、甜笋竹、油苦竹、少穗竹、黄竿乌哺鸡竹)

2.5 24种竹笋蛋白对胃癌细胞株SGC7901和结肠癌细胞株HCT116的半抑制浓度

根据各不同梯度浓度的竹笋蛋白作用于肿瘤细胞的不同增殖抑制率，采用GraphPad Prism 软件，计算其半数抑制浓度(或称半抑制率)，即IC50值，见表2(表中毛竹、曲竿竹和篌竹因其竹笋蛋白不同梯度浓度的抑制率值异常，无法计算其IC50值)。一般IC50的数值越小，说明其抑制肿瘤细胞增殖的特异性能越强。从表2数据分析可知，对胃癌细胞株SGC7901抑制率最强的是花毛竹，其次是篌竹，然后依次是紫竹、毛竹、曲竿竹、花哺鸡竹、甜笋竹、角竹、短穗竹、水竹、油苦竹、黄曲竿竹、寿竹、黄古竹、木竹、金明竹、白哺鸡竹、黄纹竹、

表2 24种竹笋蛋白对肿瘤细胞抑制的IC50值Tab.2 IC50 values of protein of 24 species of bamboo shoots in inhibiting tumor cells

橄榄竹、富阳白哺鸡竹、奉化水竹、紫蒲头灰竹、少穗竹，抑制率最弱的是黄竿乌哺鸡竹。对结肠癌细胞株SGC7901抑制率最强的是花毛竹，其次是水竹，然后依次是木竹、黄纹竹、奉化水竹、寿竹、黄古竹、黄曲竿竹、白哺鸡竹、油苦竹、金明竹、角竹、紫蒲头灰竹、甜笋竹、少穗竹、橄榄竹、黄竿乌哺鸡竹、富阳乌哺鸡竹、花哺鸡竹、短穗竹，抑制率最弱的是紫竹。花毛竹是其中对胃癌细胞株SGC7901和结肠癌细胞株HCT116的增殖抑制率均最强的竹种，而其他竹种的竹笋蛋白对这2种肿瘤细胞的增殖抑制作用并无呈现出一定的种属特异性规律。

3 结论与讨论

竹笋蛋白对肿瘤细胞，如胃癌细胞SGC7901和结肠癌细胞HCT116均有显著的抑制作用。同一种竹笋蛋白对不同肿瘤细胞的抑制率不完全相同，并与竹笋蛋白的浓度密切相关。在胃癌细胞SGC7901中，奉化水竹、黄古竹、油苦竹、黄纹竹、少穗竹和黄竿乌哺鸡竹的竹笋蛋白浓度与细胞增殖抑制率成正比，随浓度的增加细胞增殖抑制率越明显。此外，对于多数竹笋蛋白，低浓度处理细胞时，随蛋白浓度的增加细胞增殖抑制率降低，但是高浓度处理时，浓度越高，细胞增殖抑制率也越高。对于结肠癌细胞HCT116，花毛竹、黄曲竿竹、奉化水竹、木竹、紫蒲头灰竹、黄纹竹、寿竹、白哺鸡竹、黄古竹、少穗竹和黄竿乌哺鸡竹的竹笋蛋白浓度与细胞增殖抑制率成正比。对于橄榄竹、金明竹、短穗竹、角竹、花哺鸡竹和毛竹，低浓度处理细胞时，随蛋白浓度的增加细胞增殖抑制率降低，但是高浓度处理时，浓度越高，细胞增殖抑制率也越高。对于其他竹笋蛋白，不同浓度作用于细胞时，细胞增殖抑制率不规律，但仍可以抑制细胞增殖。总之，在一定浓度范围内，竹笋蛋白浓度越高对胃癌细胞SGC7901和结肠癌细胞HCT116的抑制作用越明显。本文仅仅在胃癌细胞株SGC7901和结肠癌细胞株HCT116中研究这24种竹笋蛋白对癌细胞增殖的影响，其对其他癌细胞株的增殖是否具有抑制作用尚不明确，以及他们抑制细胞增殖的作用机制也不清楚，后续研究将进一步探讨这些问题。

在相关蛋白类药物的研究中表明[13-14]：与传统抗肿瘤药物相比，蛋白类药物在有效增强药效的同时，对机体正常细胞、组织的损伤较小，这是蛋白类药物研究的又一大突破性的优势。对于竹笋蛋白抑制胃癌细胞以及结肠癌细胞增殖的发现，我们试图从中筛选出影响多种癌细胞增殖活性较相似的竹笋蛋白，进一步探究抑制细胞增殖的机制，为抗癌新药的研究提供新的理论依据。