应用Logistic方程确定巨龙竹叶片低温半致死温度

徐 田，毕 玮,2，陈 剑,2

(1.云南省林业科学院，云南 昆明 650201; 2.国家林业局重点开放性实验室云南珍稀濒特森林植物保护和繁育实验室；云南省森林植物培育与开发利用重点实验室，云南 昆明 650201)

巨龙竹(Dendrocalamussinicus)又名歪脚龙竹，禾本科竹亚科牡竹属竹种，秆高20～30 m，直径20～30 cm，花期10月至次年5月，果期12月至次年7月[1-3]。巨龙竹是目前所知世界上最高大的竹子，也是生长最快，秆形最高大，单秆出材率和单位面积产量最高的竹种，单秆重量可达79～100 kg，每丛平均有15～30株，其生长速度快、经济用途广、生态效益显著的特点，使其作为特色明显的资源之物，有很大的开发潜力和广泛的应用前景。并且巨龙竹地下茎根系统发达，有很好的固土保水能力，是优良的生态防护竹种。巨龙竹是热性巨大型丛生竹，分布区域非常狭窄，就目前所知巨龙竹仅分布于我国云南的西南部边缘的热带和南亚热带中山山地，海拔500～1 870 m，年均气温15～22.5 ℃，极端低温不低于-5.4 ℃，最冷月平均气温不低于10 ℃，年总光照时数在1 800 h以上，年平均有霜日数不超过12 d，年平均降雨量1 278 mm以上[4]。以普洱市的西盟、澜沧、孟连和临沧市的沧源、耿马、双江、镇康、永德为原产地，在西双版纳的勐海、景洪、勐腊等地的河谷坝区引种栽培。因巨龙竹分布区也是佤族、傣族、拉祜族等少数民族聚集区，其在种质资源、地理分布、人文文化上都具有不可替代性，是非常珍稀、特有的竹种。由于具有较大的推广价值和较窄的分布范围，对于巨龙竹的抗逆性研究已经迫在眉睫。温度成为巨龙竹扩大分布范围的关键性制约因素，对于其抗寒性能的研究，已成为推广巨龙竹需解决的首要问题，也是发展巨龙竹产业的重中之重[1-3]。

植物抗寒性是植物抵御外界低温等不良环境时表现的自适应能力，这种能力包括了植物自身的遗传变异以及环境对植物的自然选择[5]。自然界中，影响植物生长的最为重要的环境因子之一是温度，它很大程度上决定了植物的一些生长发育、生命进程等生命重要环节[6]。决定植物的分布和引种最重要的因素之一是温度，低温会对植物生长、结果、生产等产生严重危害。低温胁迫指环境温度在植物正常生长所需最适温度以下，包括冷害和冻害[7-8]。朱根海等的研究表明应用相对电导率和Logistic 方程求拐点温度能比较准确地估计出植物组织的低温半致死温度,此方法适用于多种植物的抗寒性研究[9]。试验通过对巨龙竹幼苗叶片进行人工低温胁迫，用相对电导率和Logistic 方程计算半致死温度，为以后巨龙竹引种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料用2年生实生巨龙竹幼苗，巨龙竹多用2年生幼苗在雨季造林，造林后第1个冬季是对巨龙竹幼苗抗寒性考验最为严竣的1个季节。实生种子采集于西盟县中课乡，地理位置为22°43′41″ N， 99°32′29″ E，海拔1 295 m；中课乡属亚热带南亚热带湿润季风气候，年降雨量2 235 mm，年日照量达1 693.6 h，干湿气候分明，土壤主要以砖红壤和赤红壤为主，土壤质地偏酸，缺钙少磷。收集到种子后在云南省林业科学院树木园大棚内实生育苗，云南省林业科学院昆明树木园土壤类型为红壤，海拔1 968 m，年平均气温14.7 ℃，最高气温31.5 ℃，最低气温-7.8 ℃，≥10℃的积温4 799.3 ℃，平均无霜期280 d，全年日照时数≥2 249.3 h；年降水量1 100 mm，相对湿度72%。

1.2 方法

1.2.1低温胁迫试验方法 2014年12月进行，在巨龙竹苗中部的部位上采集成熟、完整、无病虫害的叶片，放入已贴好标签的自封袋中，带回实验室后用自来水清洗叶片，然后用蒸馏水冲洗3次，用滤纸将水分吸干。取自封袋的叶片分为5组，以调温冰箱为低温控制设备，温度梯度设置为： 5、0、-5、-10、-15 ℃，每级温度处理24 h。根据以往观测，巨龙竹在温度达到2～0 ℃时，表面即有受伤表现，耐受极端低温为-5.4 ℃，将测试温度定于5～-15 ℃之间。每个梯度处理完毕后，先对处理后的材料外观观测，之后迅速测定其相对电导率。每个处理测试3个样品，取平均值。

1.2.2相对电导率的测定方法 测定时，沿叶柄向叶尖处打孔，孔径0.6 cm，取15片叶圆片放入试管中加入20 mL蒸馏水，封口后在水平摇床上震荡1 h后在沸水中加热20 min，冷却到室温，蒸馏水设为空白对照，用奥利龙150A型电导率仪分别测定加热前电导值C1，及加热后电导值C2，及对照电导率C0，3次重复。并按以下公式计算相对电导率：

相对电导率=(C1-C0)/(C2-C0)×100%

式中：C0—蒸馏水电导率；C1—煮前电导率；C2—煮后电导率。

1.3 数据计算

数据整理、计算、汇总以及半致死低温计算用Microsoft Office Excel 2010软件完成，用SPSS 18.0完成重复测量方差分析。

2 结果与分析

2.1 温度对相对电导率的影响

经过24 h的人工低温处理后，在不同的温度梯度下，巨龙竹叶片在形态上无明显变化，无褐变，无失水卷曲。低温对植物组织造成伤害后，细胞膜透性会受到损坏，细胞膜内电解质渗出会有所变化，细胞膜透性越大，胞内电解质外渗量也相应增加。相对电导率是表现低温造成的细胞膜受损前后胞内电解质渗出率。一般认为相对电导率增加的程度一定程度上反映了植物组织细胞膜受伤害的程度，同时也反映了细胞抗性的大小，很多情况下相对电导率也可作为植物抗寒性强弱评价的一个可靠指标[10-11]。

图1 巨龙竹叶片在低温胁迫下相对电导率变化曲线Fig.1 The relative conductivity of bamboo leaves under low temperature stress

随着温度的降低，巨龙竹幼苗叶片电导率呈现出逐渐升高的趋势(图1 )，表明温度与相对电导率呈负相关关系。5 ℃到0 ℃时，相对电导率只是少量增加，说明叶片细胞膜受伤害不明显；从0 ℃到-5 ℃时，电导率急剧升高，由32%迅速上升到68%，说明当温度下降至-5 ℃时，巨龙竹叶片细胞膜受伤害严重；之后上升速度又趋于平缓。随温度的降低，相对电导率变化曲线呈“S”型，相对电导率随温度的变化基本遵循Logistic 曲线的变化规律，即呈缓慢增加、快速增加、平缓增加的趋势，因此降温对膜透性破坏性效应的最大值在S 曲线上为拐点所对应的数值，在抗寒研究上即为低温半致死温度(LT50)[12-13]。

2.2 配合Logistic方程求半致死温度

Sukumaran 等提出电解质外渗率50%时的温度为组织的低温半致死温度[14],而朱根海等认为可以用Logistic 方程中拐点温度来表示植物组织的低温半致死温度(LT50)[9],罗正荣等认为细胞电解质外渗率(REC)配以Logistic 方程两者具有很好的拟合度[15]。Logistic方程是一个 “S”型曲线方程，其拟合方程为y=k/(1+ae-bx)(k，a，b为常数)，拐点温度为半致死温度(LT50)，即(d2y/dx2)=0时的x值[16]。根据本实验巨龙竹幼苗叶片在低温处理下的电导率，拟合Logistic方程：Y=K/(1+ae-bt)，拟合值R为0.907(P<0.05)，呈显著水平，说明在巨龙竹抗寒研究中，不同低温处理的电解质外渗率遵循Logistic方程的变化规律，其拟合结果比较可靠，精确度较高[16]。确定拐点温度(LT50)，即为其半致死温度为-2.16 ℃，具体的Logistic方程及参数、半致死温度见表1。

表1 巨龙竹低温半致死温度Tab.1 The semi-lethal low temperature of Dendrocalamus sinicus

3 结论

低温胁迫伤害时，植物最先受损部位是膜系统，低温会引起细胞膜的不均匀收缩、膜脂相变、膜脂过氧化以及冰冻造成的机械胁迫等都会伤害到细胞，细胞膜的半透性丧失，细胞电解质外渗，细胞膜损伤越严重则离子渗出率越高，因此可通过测定电解质渗漏情况来确定植物的受害程度[11]。

试验结果表明，经过24 h的人工低温处理后，在不同的温度梯度下，巨龙竹叶片在形态上无明显变化，无褐变，无失水卷曲；巨龙竹叶片经过低温胁迫后，随温度的降低相对电导率会增加，呈“S”型变化，应用Logistic方程计算其半致死温度为-2.16 ℃，相关系数0.907，表明低温胁迫下的相对电导率遵循Logistic 方程的变化规律。

4 讨论

试验所设置的低温胁迫时间是24 h，对于48、72 h及更长时间的持续低温胁迫是否适用还需进一步验证。同时试验仅研究了低温胁迫下2年生巨龙竹幼苗的离体叶片，对于多年生以及整株的测定还需进一步研究。

植物生理过程是极其复杂的，影响巨龙竹抗寒性能的因素也是多方面的，要进一步研究其抗寒机能，需要综合其他生理生化指标进行全面评价。

图2 低温胁迫后巨龙竹幼苗叶片状态Fig.2 Leaf state of Dendrocalamus sinicus seedlings after low temperature stress