高效液相色谱法测定复方银杏通脉口服液中总黄酮醇苷含量*

2018-10-25 11:10杨跃龙
中国药业 2018年20期
关键词:通脉槲皮素批号

张 耕,刘 译,唐 勇,杨跃龙

(湖南省怀化市食品药品检验所,湖南 怀化 418000)

复方银杏通脉口服液主要由银杏叶、(制)何首乌、女贞子、丹参、杜仲、川牛膝、钩藤7种中药组方,具有滋阴补肾、舒肝通脉功效,临床主要用于治疗中老年人轻度脑动脉硬化所致头晕头痛、耳鸣耳聋、视物模糊、记忆力减退、腰膝酸软、肢体麻木等。复方银杏通脉口服液现行国家药品标准中,只对制何首乌有液相含量定量测定,而银杏叶检验只有银杏叶对照药材薄层色谱定性鉴别,没有银杏叶相关液相含量定量测定。现有研究表明,银杏叶主要有效活性成分为总黄酮醇苷(槲皮素、山柰素与异鼠李素)和萜类内酯,总黄酮醇苷具有活血化瘀、通络止痛、敛肺平喘、化浊调脂等功效。有关银杏总黄酮醇苷的研究报道[1-16]较多,为了更有效地控制产品质量,本研究中参照 2015 年版《中国药典(一部)》[17]银杏叶总黄酮醇苷含量测定项相关方法,对复方银杏通脉口服液中总黄酮醇苷采用高效液相色谱(HPLC)法进行定量分析,以完善该制剂现行质量标准。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT型高效液相色谱仪(包括LC-20AT四元泵,SPD-M20A紫外检测器,SIL-20A自动进样器,LCsolution色谱工作站,日本岛津公司);HH-6型数显恒温水浴锅(温度控制范围0.0~100.0℃,常州智博瑞仪器制造有限公司);XSE105DU型十万分之一电子分析天平(梅特勒-托利多公司);Direct-Q3型纯水机(美国密理博公司)。

1.2 试药

槲皮素对照品(纯度为98.1%,批号为100081-201509),山柰素对照品(纯度为 93.2% ,批号为110861-201310),异鼠李素对照品(纯度为 100.0%,批号为110860-200608),均由中国食品药品检定研究院提供,供含量测定用;复方银杏通脉口服液(规格为每瓶 1 mL,批号分别为 20160305,20160306,20160401,湖南补天药业有限公司);阴性样品(规格为每瓶10 mL,批号为20160127,湖南补天药业有限公司);甲醇(色谱纯,批号为 I0887507 717,Merck KgaA公司);磷酸(色谱纯,批号为20170801001,天津赛孚瑞科技有限公司);盐酸(优级纯,批号为20161128,国药集团化学试剂有限公司);水为Millipore Direct-Q3型纯水机制备的超纯水,其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Shimadzu C18柱(250 mm ×4.6 mm,5 μm);流动相:甲醇-0.4%磷酸溶液(55∶45);流速:1.0mL/min;柱温:25 ℃;检测波长:360 nm;进样量:10 μL。理论板数按槲皮素峰计应不低于2 500,分离度按山柰素与异鼠李素峰计算应大于1.5。

2.2 溶液制备

对照品溶液:分别称取槲皮素、山柰素与异鼠李素对照品 20.20,21.41,10.60 mg,精密称定,置 100 mL容量瓶中,加甲醇使溶解并稀释至刻度,摇匀,再精密量取15 mL,置200 mL容量瓶中,加甲醇使溶解并稀释至刻度,摇匀,即得每1 mL含槲皮素、山柰素与异鼠李素对照品分别为 14.86,14.96,7.95 μg 的混合对照品溶液。

供试品溶液:取装量差异项下的本品,混合均匀,精密量取10 mL,加甲醇 16 mL,18%盐酸8.0 mL,置沸水浴中加热回流90 min后,自然冷却至室温,移至50 mL容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,混匀,用0.45 μm微孔滤膜滤过,取滤液,作为供试品溶液。

阴性对照品溶液:取阴性样品,按供试品溶液制备方法制得阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验:分别精密吸取2.2项下3种溶液各10 μL,按拟订色谱条件注入色谱仪,测定。结果阴性对照品溶液色谱中,在与供试品溶液相同保留时间处无色谱峰出现,表明阴性对照无干扰。详见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察:精密吸取含槲皮素、山柰素与异鼠李素的混合对照品溶液各10 μL,质量浓度分别为(1.48,1.49,0.79),(1.98,1.99,1.06),(3.96,3.99,2.12),(5.94,5.98,3.18),(7.92,7.98,4.24),(9.90,9.97,5.30),(14.86,14.96,7.95)μg /mL,进样 10 μL,以峰面积(Y)为纵坐标、质量浓度(X)为横坐标绘制标准曲线,得回归方程。结果见表1。

表1 线性关系考察结果(n=7)

精密度试验:精密吸取同一含槲皮素、山柰素与异鼠李素对照品溶液各10 μL,按拟订色谱条件连续进样6次。结果峰面积平均值槲皮素为207 448.2,山柰素为191 774.5,异鼠李素为 71 797,RSD分别为 0.75% ,0.38%,0.81%(n=6),表明仪器精密度良好。

稳定性试验:取同一批(批号为20160401)样品,依法制备供试品溶液,分别于 0,1,2,4,8,12 h 时进样10 μL,记录峰面积。结果峰面积的平均值槲皮素为221 367.8,山柰素为 205 558,异鼠李素为 78 177,RSD分别为 0.43% ,0.47% ,0.98% (n=6),表明供试品溶液在12 h内稳定。

重复性试验:取同一批(批号为20160401)样品,依法平行制备供试品溶液6份,按拟订色谱条件分别进样10 μL测定。结果峰面积的平均值槲皮素为201 601,山柰素为190 075.5,异鼠李素为71 065,RSD分别为0.76%,1.35%,1.44%(n=6),表明方法重复性良好。

定量限检测:称取槲皮素、山柰素、异鼠李素对照品,精密称定,配成每 1 mL 各含 0.150,0.150,0.075 μg的混合溶液,取20 μL注入液相色谱仪。结果表明,信噪比(S/N)≈10时,槲皮素、山柰素、异鼠李素的定量限分别为 0.003 0,0.003 0,0.001 5 μg。

加样回收试验:分别精密量取6份已知含量的样品(批号为 20160401,质量浓度为槲皮素 25.70 μg /mL、山柰素 22.75 μg /mL、异鼠李素 9.78 μg /mL)溶液7 mL,分别精密加入混合对照品溶液(质量浓度为槲皮素 49.54 μg/mL、山 柰 素 49.88 μg /mL、异 鼠 李 素26.50 μg /mL)3 mL,按供试品溶液制备方法制备溶液,进样测定,计算回收率。结果见表2至表4。

2.4 样品含量测定

按外标法以峰面积分别计算槲皮素、山柰素与异鼠李素的含量,以下列公式换算成总黄酮醇苷的含量:总黄酮醇苷含量=(槲皮素含量+山柰素含量+异鼠李素含量)×2.51。结果见表 5。

表2 槲皮素加样回收试验结果(n=6)

表3 山柰素加样回收试验结果(n=6)

表4 异鼠李素加样回收试验结果(n=6)

表5 样品中总黄酮醇苷的含量测定结果(μg/mL,n=3)

3 讨论

3.1 水浴温度及回流时间选择

试验表明,水浴温度及回流时间对酸水解结果影响较大。取同一批样品(批号为20160401)测定,当水浴温度为85℃、回流时间为45 min,测得总黄酮醇苷含量为108.43 μg /mL;85 ℃ ,60 min,含量为 117.84 μg /mL;90 ℃,60 min,含量为 135.85 μg/mL;90 ℃,90 min,含量为 141.27μg/mL;100℃,90min,含量为 144.65μg/mL;100 ℃ ,105 min,含量为 142.39 μg /mL。最终选择总黄酮测得含量最高的条件(即100℃水浴中加热回流90 min)对样品进行酸水解。

3.2 流动相选择

曾采用2015年版《中国药典(一部)》银杏叶中总黄酮醇苷含量测定方法中采用的流动相条件,即甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶50),对样品进行测定,但山柰素峰与异鼠李素峰分离效果不理想。采用2.1项下流动相条件,即甲醇 -0.4%磷酸溶液(55 ∶45),很好地解决了山柰素峰与异鼠李素峰分离度的问题(>1.5),符合色谱系统适用性条件要求,可用于本制剂中总黄酮醇苷含量测定。

3.3 方法适用性

本试验中建立了复方银杏通脉口服液中总黄酮醇苷的含量测定方法,以槲皮素、山柰素和异鼠李素为对照品,采用HPLC法测定,方法简单、结果准确、数据重复性、精密度都良好,方法专属性较强,适用于复方银杏通脉口服液的质量控制。

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