维生素CE咀嚼片对小鼠生殖细胞和体细胞的遗传毒性研究*

高 翔 ，马鹏飞 ，崔亚宁 ，唐 娜 △，马 丽

（1．陕西省食品药品监督检验研究院，陕西 西安 710065； 2．陕西省咸阳市中心医院药学部，陕西 咸阳 712000）

维生素是维持人体正常生命代谢和某些特殊生理功能不可缺少的低分子有机化合物［1］。各种维生素均必须达到一定的摄入量才能维持机体的正常生理机能，摄入过多或过少均会引起生理疾病［2］。维生素CE咀嚼片是以维生素C和维生素E为主要原料制成的保健食品，用于补充维生素C和维生素E。保健食品可调节机体功能，但不以治疗疾病为目的，为了更好地控制其质量，应评价其致突变性［3］。本研究中以小鼠精子畸形率和骨髓细胞微核率为指标，对维生素CE咀嚼片进行了安全性评价。现报道如下。

1 材料与方法

1．1 仪器与试药

BS2202S型电子天平（赛多利斯公司）；BX43F型电子显微镜（奥林巴斯公司）；解剖器材，细胞计数器。环磷酰胺（Sigma公司，批号为SLBG4216V）；伊红染料（批号为 20110809），甲醇（分析纯，批号为 20131206），Giemsa色素（批号为20140616），均为国药集团化学试剂有限公司产品；小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批号为131103）；中研通牌维生素CE咀嚼片（陕西仁康药业有限公司，批号为121002）。

1．2 试验动物

SPF级雄性BALB／c种小鼠25只，体质量25～30 g，用于小鼠精子畸形试验；BALB／c种小鼠50只，雌雄各半，体质量18～22 g，用于骨髓细胞微核试验。动物均由第四军医大学实验动物中心提供，生产许可证号为SCXK（陕）2014-002。动物室温度 22～26℃，相对湿度40%～70%。实验动物使用许可证号为 SYXK（陕）2013-001。

1．3 方法

小鼠精子畸形试验［4-5］：将25只雄性小鼠随机分为5组，各5只。本实验室测得维生素CE咀嚼片的半数致死量（LD50）为 3．2 g ／kg。按照LD50的 1 ／2，1 ／4，1 ／8 试验，分为高（1．6 g／kg）、中（0．8 g／kg）、低（0．4g ／kg）3个剂量组，另设阴性对照组（采用蒸馏水灌胃）和阳性对照组（采用环磷酰胺40 mg／kg灌胃）。各组动物灌胃体积为20 mL／kg，每日经口灌胃1次，连续灌胃5 d，于首次给受试物后第35天颈椎脱臼处死，取两侧副睾，放入盛有1．5 mL生理盐水的平皿中，用眼科剪将副睾纵向剪1～2刀，静置3～5 min，用4层擦镜纸过滤，吸滤液涂片，空气干燥后，用甲醇固定10 min，1%伊红染色1 h后，用水轻冲，干燥。在高倍镜下每只动物计数1 000条完整精子，记录精子畸形类型（无钩、香蕉形、无定型、胖头、尾折叠、双头、双尾等）、畸形数，并计算畸形率［6］。

小鼠骨髓细胞微核试验［7］：将50只小鼠（雌雄各半）随机分为5组，各10只，分组及剂量同小鼠精子畸形试验。经口连续灌胃2 d，第2天给受试物后6 h颈椎脱臼处死小鼠，取小鼠股骨骨髓，常规涂片，自然干燥后，放入甲醇中固定10 min，将固定好的涂片在Giemsa应用液中染色10 min，立即用蒸馏水冲洗，晾干。在油镜下观察，每只动物计数1 000个嗜多染红细胞，分别计算雌、雄小鼠各试验组的嗜多染红细胞与正染红细胞（PCE／RBC）比值和嗜多染红细胞（PCE）微核率。微核检出率以千分率表示［8-9］。

1．4 统计学处理

采用SPSS 19．0统计学软件分析。计量资料采用t检验，计数资料精子畸形采用Wilcoson秩和检验，骨髓细胞微核采用 χ2检验，按动物性别分别统计。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

结果见表1和表2、图1和图2。

3 讨论

正常情况下，人或其他哺乳动物的精液中存在少量畸形精子，正常小鼠的精子畸变范围一般为0．8%～3．4%，不同品系小鼠的精子畸形率基础值差异较大。林建等［10］的研究表明，美国癌症研究所（ICR）小鼠更适合作为小鼠精子畸形试验的材料。但目前研究少见有统计BALB／c小鼠的基础值。本试验条件下，BALB／c小鼠的精子畸形率低至2．28%，表明维生素CE咀嚼片对小鼠精子畸形无影响。

表1 小鼠精子畸形试验结果（n＝5）

表2 小鼠骨髓细胞微核试验结果（n＝10）

图1 小鼠精子畸形类型（1%伊红染色，1 000倍）

图2 小鼠骨髓细胞微核形成（Giemsa应用液染色，1 000倍）

微核的形成是细胞受遗传毒性物质作用后的遗传学终点［11］，因此广泛用于检测新药、食品和化妆品等是否具有诱导染色体或有丝分裂器损伤的作用［12］。由骨髓细胞微核试验结果可知，受试物同一剂量组内雌、雄小鼠之间微核无明显的性别差异，且受试物各剂量组雌、雄小鼠微核率与阴性对照组比较，均无显著性差异，而与阳性对照组比较差异极显著，表明在本试验条件下，维生素CE咀嚼片对小鼠骨髓细胞微核无明显影响。

由于人们生活水平的提高及保健意识的增强，通过服用保健食品来预防疾病逐渐兴起。作为广泛应用的可增强免疫力的保健食品，维生素CE咀嚼片在本试验剂量下对小鼠精子畸形率和骨髓细胞微核率无明显影响，对小鼠生殖细胞和体细胞均无致遗传毒性作用。