GC法测定富马酸替诺福韦二吡呋酯的残留溶剂

袁秀菊 宿亮 赵静芝 王玲兰 袁红波

摘 要 目的：建立顶空毛细管GC法同时测定富马酸替诺福韦二吡呋酯原料药中乙醇、异丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮7种残留溶剂的分析方法。方法：采用Agilent DB-624色谱柱，FID检测器，二甲基亚砜（DMSO）为溶剂。结果：在选定的色谱条件下，各溶剂峰均能良好分离，溶剂乙醇、异丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮分别在相应浓度范围内与峰面积呈良好线性关系。各溶剂最低检测限符合要求。结论：经方法学验证，本法可用于富马酸替诺福韦二吡呋酯的残留溶剂测定。

关键词 核苷酸类抗病毒药 富马酸替诺福韦二吡呋酯 残留溶剂 气相色谱法

中图分类号：O657.71 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2018）19-0077-04

Determination of residual solvents of tenofovir disoproxil fumarate by GC

YUAN Xiujyu*， SU Liang， ZHAO Jingzhi， WANG Linglan， YUAN Hongbo

（Institute of Chemical Material Medica， Academy of Qianjin， Qianjin Group， Hunan Zhuzhou 412003， China）

ABSTRACT Objective： A capillary GC method with head-space sampling was established for determination of residual solvents including ethanol， isopropanol， dichloromethane， ethyl acetate， tetrahydrofuran， N， N-dimethylacetamide and N-methyl-2-pyrrolidone in raw material of tenofovir disoproxil fumarate. Methods： GC was performed on Agilent DB-624 capillary column with FID as detector and DMSO as the solvent. Results： The peaks of these residual solvents could be completely separated from the main constituent. The calibration curves of these solvents showed good linearity with their peak areas over the ranges of related concentrations， respectively. The limit of detection of each solvent could meet the requirements. Conclusion： It is proved by the methodological validation that this method can be used for the determination of the residual solvents remained in tenofovir disoproxil fumarate.

KEy WORDS nucleotide antiviral drug； tenofovir disoproxil fumarate； residual solvents； gas chromatography

富马酸替诺福韦二吡呋酯片（商品名：韦瑞德，Viread），是美国吉利德（Gilead）公司开发上市的一种核苷酸类抗病毒药[1]。2001年经美国FDA批准上市用于治疗抗人免疫缺陷病毒（HIV），后增補抗乙型肝炎病毒（HBV）活性。替诺福韦是一种无环的5-单磷酸腺苷类似物，其首先需要经二酯的水解转化为替诺福韦，然后通过细胞酶的磷酸化形成二磷酸替诺福韦。二磷酸替诺福韦通过与天然底物5-三磷酸脱氧腺苷竞争，并且在与DNA整合后终止DNA链，从而抑制HIV-1逆转录酶的活性[2-5]。此外，体内外研究表明，替诺福韦对HBV野生株、拉米夫定耐药株、阿德福韦耐药株均有较好抑制作用，给对拉米夫定或阿德福韦耐药患者提供了一个新型抗乙肝药物的选择。

由于该原料药在制备过程中使用了有机溶剂乙醇、异丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮，而依据人用药品注册技术规范国际协调会（ICH）提出的残留溶剂指导原则，这些溶剂均被列为药品必须限制的第二、三类有机溶剂[6]，因此为保证药品质量和用药安全，对该原料药进行有机溶剂残留量检测就显得尤为重要。

目前，有文献报道测定富马酸替诺福韦二吡呋酯中乙醇、异丙醇、乙酸乙酯等溶剂的方法，但未见高沸点溶剂N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮测定方法的相关报道[7-8]。为加强富马酸替诺福韦二吡呋酯的质量控制，本文在详细研究的基础上建立了GC法测定富马酸替诺福韦二吡呋酯中7种溶剂的测定方法，结果表明，该方法操作简单，灵敏度高，专属性强，可用于富马酸替诺福韦二吡呋酯的残留溶剂测定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

Agilent 7890型气相色谱仪（配备FID检测器和7697A型顶空进样装置）及Agilent 1260工作站（美国Agilent公司）。

溶剂对照品：N-甲基吡咯烷酮、乙醇（Tedia公司，HPLC级）；二氯甲烷、乙酸乙酯（天津市化学试剂研究所，HPLC级）；异丙醇、四氢呋喃（国药集团化学试剂有限公司，HPLC级）；N，N-二甲基甲酰胺（国药集团化学试剂有限公司，分析级）；二甲基亚砜（Honeywell，HPLC级）；富马酸替诺福韦二吡呋酯（湖南千金湘江药业股份有限公司自制）。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

Agilent DB-624柱（30 m×0.32 mm×1.8 mm）；載气：N2，按表1进行程序升温；进样口温度：150 ℃，检测器温度：250 ℃，顶空瓶平衡温度：100 ℃，平衡时间：30 min。

1.2.2 对照、供试溶液的配制

对照品溶液 精密称取各溶剂对照品适量，分别加二甲基亚砜溶解并稀释制成每1 ml中含乙醇、异丙醇、乙酸乙酯各0.5 mg、二氯甲烷0.06 mg、四氢呋喃0.072 mg、N，N-二甲基甲酰胺0.088 mg和N-甲基吡咯烷酮1.0 mg的混合溶液，精密量取5 ml，置顶空瓶中，密封，作为混合对照品溶液。

供试品溶液 取富马酸替诺福韦二吡呋酯约0.5 g，精密称定，置顶空瓶中，精密加入5 ml二甲基亚砜使溶解，密封，作为供试品溶液。

1.2.3 空白溶液、定位溶液配制

1）空白溶剂干扰试验 精密量取空白溶剂二甲基亚砜5 ml，置顶空瓶中，密封。

2）定位溶液配制 分别取乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮适量，精密称定，分别加入二甲基亚砜溶解并定量稀释制成1 mg/ml的定位溶液，再分别精密量取5 ml，置顶空瓶中，密封，分别依法测定。

1.2.4 溶液稳定性样品配制

同时平行配制6份供试品溶液，置室温下放置，分别于第1、2、4、6、8、12小时时，依法测定，考察供试品溶液中各溶剂残留量的变化情况。

1.2.5 线性试验溶液配制

分别用二甲基亚砜稀释制成含乙醇、异丙醇、乙酸乙酯各5.0 mg/ml、二氯甲烷0.6 mg/ml、四氢呋喃0.72 mg/ml、N，N-二甲基甲酰胺0.88 mg/ml和N-甲基吡咯烷酮10 mg/ml的混合照品储备液。分别精密量取储备液1 ml置100 ml、50 ml、20 ml、10 ml量瓶及2 ml至10 ml量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，即得一系列线性试验溶液。

1.2.6 回收率试验样品配制

1）混合对照品溶液的制备 照线性试验溶液配制混合对照品溶液储备液（浓度为限度的10倍），精密量取10 ml、4 ml、6 ml，分别置50 ml、25 ml、25 ml量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，即得三个浓度的混合对照品溶液（80%、100%、120%）。

2）混合对照80%+供试品溶液的制备 取供试品约0.5 g，精密称定，置顶空瓶中，精密加入混合对照品溶液（80%浓度）5 ml使溶解，密封，作为混合对照80%+供试品溶液，平行配制3份，依法测定。100%、120%混合对照溶液如法配制。

2 结果

2.1 系统适用性试验

各峰的保留时间分别为：乙醇4.640 min、异丙醇5.652 min、二氯甲烷6.121 min、乙酸乙酯8.197 min、四氢呋喃8.480 min、N，N-二甲基甲酰胺14.296 min和N-甲基吡咯烷酮20.694 min（表2）；气相色谱图见图1，溶剂峰和各溶剂之间分离度均符合要求。

2.2 专属性试验

精密量混合对照品溶液5 ml置顶空瓶中，依法测定，各溶剂峰型良好，分离度均大于1.5，表明该法的专属性较强。

2.3 溶液稳定性试验

供试品溶液残留溶剂量的绝对变化量均≤0.02%，测定结果无明显变化，供试品溶液在室温条件下放置12 h保持稳定。

2.4 重复性试验

6份残留溶剂测定结果的相对标准偏差均在10%以内，表明该方法重复性良好。

2.5 线性试验

以峰面积A为纵坐标，以浓度C（mg/ml）为横坐标进行线性回归，所得回归方程（n=6）及线性范围见表3。

结果表明，各溶剂在各自的线性范围内，浓度均与峰面积呈良好线性关系。

2.6 检测限和定量限

以信噪比约为3时计算检测限，以信噪比约为10时计算定量限，测得各溶剂的定量限及检测限见表4。

2.7 回收率试验

按外标法计算，结果溶剂乙醇、异丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮的平均回收率依次为103.4%、104.2%、102.8%、101.0%、99.4%、104.6%、94.3%，回收率在80～120%范围之内；RSD依次为2.52%、3.95%、2.42%、2.78%、2.60%、4.26%、3.54%，小于5%，符合要求（n=9）。

2.8 耐用性试验

分别考察顶空瓶平衡时间（±5 min）、起始温度（±5℃）和分流比（±5∶1）等色谱条件的微小变化对色谱系统适用性和残留溶剂测定结果的变化情况。各条件下各溶剂峰理论塔板数（>500）、拖尾因子（<3.0）和分离度（>1.5）等均符合要求，残留溶剂测定结果均无明显变化，表明本法测定富马酸替诺福韦二吡呋酯残留溶剂耐用性良好。

2.9 样品测定

同时测定3批样品，以外标法计算各溶剂含量，二氯甲烷、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺及和N-甲基吡咯烷酮均未检出，各溶剂残留均低于富马酸替诺福韦二吡呋酯各国药典标准，产品质量合格（表5）。

3 讨论

选择直接进样方式时，由于进样口温度较高，而富马酸替诺福韦二吡呋酯样品在高温条件下不稳定，易被破坏产生未知峰，且易残留，基线噪音大，易干扰样品残留溶剂测定；选择顶空进样方式时，进样口温度可设置为较低温度，样品不易被破坏，不会干扰样品检测，且基线噪音小，故最终选择顶空进样方式测定富马酸替诺福韦二吡呋酯的残留溶剂。

成品在二甲基亚砜中溶解性较好，且不干扰各溶剂的测定，但在室温低于17 ℃左右时，二甲基亚砜易凝固，因此配制样品时应注意室温的影响，以免影响试验结果。

根据经验选择常规的平衡温度为100 ℃，平衡时间为30 min，在此条件下，样品顶空进样不会产生未知干扰峰，测定结果可重现。

参考文献

[1] Deeks SG， Barditch-Crovo P， Collier A， et al. Hydroxyurea does not enhance the anti-HIV activity of low-dose tenofovir disoproxil fumarate[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2001， 28（4）： 336-339.

[2] Barditch-Crovo P， Deeks SG， Collier A， et al. Phase i/ii trial of the pharmacokinetics， safety， and antiretroviral activity of tenofovir disoproxil fumarate in human immunodeficiency virus-infected adults[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2001， 45（10）： 2733-2739.

[3] Fung HB， Stone EA， Piacenti FJ. Tenofovir disoproxil fumarate： a nucleotide reverse transcriptase inhibitor for the treatment of HIV infection[J]. Clin Ther， 2002， 24（40）： 1515-1548.

[4] Ristig MB， Crippin J， Aberg JA， et al. Tenofovir disoproxil fumarate therapy for chronic hepatitis B in human immunodeficiency virus/hepatitis B virus-coinfected individuals for whom interferon-alpha and lamivudine therapy have failed[J]. J Infect Dis， 2002， 186（12）： 1844-1847.

[5] Porche DJ. Tenofovir disoproxil fumarate （Viread）[J]. J Assoc Nurses AIDS Care， 2002， 13（3）： 100-102.

[6] ICH指導委员会. 周海钧， 译. 药品注册的国际技术要求：质量部分[M]. 北京： 人民卫生出版社， 2000.

[7] 孙伶， 刘川. 富马酸替诺福韦二吡呋酯中残留溶剂检测方法的建立及验证[J]. 承德医学院学报， 2015， 32（2）： 142-145.

[8] 王兵. 气相色谱法测定富马酸替诺福韦二吡呋酯原料的残留溶剂[J]. 广东化工， 2015， 42（16）： 209.