赖氨酸缺乏或过量对肉鸡生长发育及脂质代谢相关基因表达的影响

田大龙 ，李燕蒙，闵育娜，王哲鹏，刘福柱，牛竹叶

（西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100）

赖氨酸是家禽玉米-豆粕型日粮中的第二限制性氨基酸，当豆粕不作为日粮蛋白主要来源时，赖氨酸成为家禽日粮的第一限制性氨基酸，其主要用于蛋白质合成，因此被称为“生长性氨基酸”[1]。肝脏是家禽脂肪代谢的主要场所，脂肪细胞产生很少量或是不能产生脂肪，脂肪的合成代谢几乎完全在肝脏[2]。有研究表明，日粮赖氨酸显著影响肉仔鸡的脂肪代谢[3-4]，随着分子生物学技术的广泛应用，近年来开展的许多功能基因和候选基因的研究证实了过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）、固醇调节元件结合蛋白（SREBP-1）、乙酰辅酶A羧化酶（ACC）等基因与脂肪代谢相关[5]。目前，关于赖氨酸的研究多集中于肉鸡的赖氨酸需要量、生产性能等方面，而赖氨酸调控肉鸡生长发育的分子机制的研究较少。本试验主要测定赖氨酸缺乏或过量对肉鸡5个肝脏脂质代谢相关基因肝脏脂肪酸结合蛋白（FABP1）、PPARs、ACC、苹果酸酶（ME）、SREBP-1表达特性的影响，旨在基于肉鸡脂质代谢层面初步探讨赖氨酸调控肉鸡生长发育和脂质代谢的分子机制，为深入揭示赖氨酸调控肉鸡生长发育的分子机制提供有益的积累。

1 材料与方法

1.1 试验设计与试验日粮 选用1日龄AA肉仔公鸡360只，随机分成3个处理，每处理6个重复，每个重复20只鸡。组间初始体重差异不显著。

基础日粮参照 NRC（1994）肉鸡饲养标准配制，采用玉米-玉米蛋白粉型基础日粮，基础日粮中赖氨酸含量为0.60%，在基础日粮中添加L-赖氨酸盐酸盐（98%）配制成3种赖氨酸水平分别为0.60%（缺乏，LL）、1.00%（适量，ML）、1.40%（过量，HL）的试验日粮，试验期3周。基础日粮组成及营养成分见表1。

表1 1～21日龄肉仔鸡基础日粮组成及营养成分（风干基础）

1.2 试验动物的饲养管理 饲养试验在西北农林科技大学畜牧生态养殖场进行，各组的饲养管理条件一致。试验鸡舍采用人工控温，前期维持每天23 h光照，雏鸡舍温度在前3 d保持在33～35℃，湿度保持在65%以上，之后平均每周降温2～3℃，直至降到25℃左右停止供温。舍饲笼养，粉料饲喂，自由采食、饮水，依常规程序进行鸡舍消毒、免疫防治及其他管理。

1.3 样品采集 试验第21天时每个重复抽取1只接近该重复平均体重的鸡，空腹12 h，称重记录，自由饮水，于第2天08:00时，屠宰前翅静脉采血5 mL，3 000 r/min 离心15 min，取血清于离心管，-20℃保存备用。

采血后解剖，分别取肝脏、胸肌、腿肌和腹脂（包括腹部脂肪和肌胃周围的脂肪）称重，计算肝脏指数、胸肌率、腿肌率、腹脂率（与活重的比值）。取部分肝脏组织样于冻存管置于液氮，用于分析脂质代谢相关基因mRNA 的相对表达量。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 生长性能 1日龄以重复为单位进行称重，记为初始体重；以重复为单位，测定试验期第21天鸡的空腹体重；计算1～21日龄的平均日增重（ADG）。在整个试验期每周统计各重复采食量，计算1～21日龄试验期间的平均日采食量（ADFI）。计算耗料增重比（F/G）。

1.4.2 血清生化 血清中总蛋白、白蛋白、尿酸、尿素氮、总胆固醇和甘油三酯含量用全自动生化分析仪进行测定（HATICHI 7180，日本）。

1.4.3 组织器官发育 分别取肝脏、胸肌、腿肌和腹脂进行称重，计算部分器官指数。

1.4.4 肝脏组织中脂质代谢相关基因mRNA转录检测选用β-肌动蛋白（β-actin）为内参基因，内参和目的基因引物根据GenBank中鸡的相关cDNA序列设计，引物均由广州赛哲生物技术有限公司合成，引物序列及参数见表2。采用Trizol（TaKaRa公司）试剂盒提取肉鸡肝脏组织总RNA，按照Promega A5001试剂盒进行逆转录反应。采用Real-PCR法测定肝脏中FABP1、PPARɑ、ACC、ME、SREBP-1基因的mRNA转录水平。

1.5 统计分析 试验数据经Excel 2016初步整理后，采用SPSS 21.0软件，以ML组为对照，分别与LL组、HL组进行独立样本t检验分析，对脂质代谢相关基因与ADG和腹脂率进行相关分析，P＜0.05为差异显著的判断标准。

2 结 果

2.1 赖氨酸缺乏或过量对肉鸡生长性能的影响 由表3可知，与ML组相比，LL组极显著降低了肉鸡ADG、ADFI（P＜0.01），极显著增加了肉鸡的F/G（P＜0.01）。HL组肉鸡ADG、ADFI和F/G与ML组差异不显著（P＞0.05）。

表2 引物序列及参数

表3 赖氨酸缺乏或过量对肉鸡生长性能的影响（n=120）

2.2 赖氨酸缺乏或过量对肉鸡血清生化指标的影响 由表4可知，与ML组相比， HL组肉鸡血清尿素氮、尿酸显著升高（P＜0.05）； 与ML组相比，LL、HL组肉鸡血清总胆固醇和甘油三酯均有升高的趋势（P＜0.10）。

表4 赖氨酸缺乏或过量对肉鸡血清生化指标的影响（n=6）

2.3 赖氨酸缺乏或过量对肉鸡肝脏指数、胸肌率、腿肌率、腹脂率的影响 由表5可知，与ML组相比，LL组极显著降低了肉鸡的胸肌率（P＜0.01），显著降低了腹脂率（P＜0.05），肝脏指数无显著影响（P＞0.05）。HL组肉鸡胸肌率、腿肌率、肝脏指数与ML组无显著差异（P＞0.05）。

表5 赖氨酸缺乏或过量对肉鸡肝脏指数、胸肌率、腿肌率、腹脂率的影响（n=6）

2.4 赖氨酸缺乏或过量对肉鸡脂质代谢相关基因表达的影响 由图1可知，与ML组相比，LL、HL组显著降低了肝脏中FABP1、ACC、ME、SREBP-1 mRNA相对表达量（P＜0.05），而HL组显著降低了PPARɑ mRNA相对表达量（P＜0.05），LL组对PPARɑ mRNA相对表达量没有显著影响（P＞0.05）。

图1 赖氨酸缺乏或过量对肉鸡脂质代谢相关基因表达的影响（n=6）

2.5 脂质代谢相关基因表达与ADG和腹脂率的相关分析由表6可知，肝脏FABP1、SREBP-1基因mRNA表达量与肉鸡ADG显著正相关（P＜0.05）；FABP1、ACC基因mRNA表达量与肉鸡腹脂率显著正相关（P＜0.05）。肝脏FABP1基因mRNA 表达量与肝脏ACC、ME、SREBP-1基因mRNA 表达量极显著正相关（P＜0.01）。肝脏PPARɑ基因mRNA表达量与肝脏ME基因mRNA表达量极显著正相关（P＜0.01）。肝脏ACC基因mRNA 表达量与肝脏ME、SREBP-1基因mRNA 表达量极显著正相关（P＜0.01）。肝脏ME基因mRNA 表达量与肝脏SREBP-1基因mRNA表达量极显著正相关（P＜0.01）。肉鸡ADG与肝脏PPARɑ、ACC、ME基因mRNA 表达量无显著相关关系（P＞0.05）。肉鸡腹脂率与肝脏PPARɑ、ME、SREBP-1基因mRNA 表达量无显著相关关系（P＞0.05）。

表6 基因表达相关分析（n=6）

3 讨 论

3.1 赖氨酸缺乏或过量对肉鸡生长发育的影响 本研究结果显示，当赖氨酸缺乏时，肉鸡的ADG、ADFI和腹脂率显著降低。这与前人的研究结果一致[6-10]。此外，氨基酸的过量添加会导致胴体脂肪率的降低[11]。本研究结果表明，当赖氨酸过量时，肉鸡的ADG、ADFI、腹脂率减少，这与Cengiz等[9]的研究结果一致。Cengiz等[9]发现，过量添加赖氨酸降低了0～21日龄肉仔鸡公鸡的体增重、屠体重和胴体重。

血清甘油三酯、总胆固醇等能反映动物体内脂肪的代谢情况。关于赖氨酸水平对家禽血清中甘油三酯影响的研究结果不一致。张婷等[4]、王文策等[12]报道，血清中的甘油三酯含量会随着赖氨酸的升高而呈先升高后降低的趋势。本试验结果表明，日粮赖氨酸无论缺乏或过量，血清总胆固醇和甘油三酯都有升高的趋势，这与刘升军等[13]研究结果一致。以上说明赖氨酸缺乏或者过量可能会导致氨基酸失衡，进而导致肝脏脂质代谢发生变化。尿酸、尿素氮是反映家禽体内蛋白质代谢的重要指标，家禽体内未被利用的氨基酸最终以尿酸的形式排出体外。本研究发现，赖氨酸过量时，血清尿素氮、尿酸显著升高。这可能是赖氨酸过量导致自身及其他氨基酸的利用率降低、蛋白质代谢增强，导致血清尿酸含量升高。

3.2 赖氨酸缺乏或过量对肉鸡脂质代谢相关基因表达的影响 肝脏是家禽中脂肪酸合成的主要部位[14]。肝脏脂肪酸代谢是最重要的脂质代谢途径，可以改变脂肪沉积[15]。ACC和ME能够调节脂肪代谢[5]。在本研究中，赖氨酸过量引起肉鸡肝组织ACC和ME的表达显著下调。ACC是脂肪酸合成的限速酶，催化脂肪酸合成的第一步反应，即乙酰辅酶A对丙二酰辅酶A的生物合成，随着体脂的增加，ACC活性增加[16]。ME是调节苹果酸代谢的关键酶，在丙酮酸转化为脂肪酸的途径中提供还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）和草酰乙酸。ME合成的NADPH是影响脂肪合成的重要因素[17]。以上分析表明，赖氨酸过量有抑制脂肪合成的效果。在本研究中，赖氨酸过量显著降低了SREBP-1的mRNA表达水平。SREBP-1是脂肪酸合成酶的转录因子，正调控脂肪酸合成的基因（ACC和FAS）表达[18-19]。说明赖氨酸过量可能通过抑制SREBP-1的表达来抑制脂肪生成，最终导致肉鸡腹部脂肪沉积减少[20]。此外，赖氨酸过量也显著降低了肝组织中PPARa的表达。PPARa作为配体活化核受体参与脂质代谢的转录调控，参与肝脂肪酸氧化。PPARa的激活诱导了脂肪酸转运蛋白的转录上调，导致脂肪酸合成表达减少。PPARa通过增加PPARa靶基因的表达来增加脂肪酸的氧化[21-23]。

本研究结果也显示，赖氨酸缺乏降低了ME、SREBP-1、ACC和FABP1基因的 mRNA 表达量。其中，ME、SREBP-1、ACC均可促进脂肪的合成，FABP1作为肝脂代谢的关键调控因子，参与脂质β-氧化，可能通过调节肝细胞PPARa表达影响脂质代谢[24-25]。这说明赖氨酸缺乏时，下调脂肪合成的关键基因导致腹脂率降低。

本研究发现，赖氨酸缺乏及其导致的氨基酸不平衡显著降低了肝脏脂肪酸的合成基因ACC、ME、SREBP-1的表达，可能是由于日粮赖氨酸缺乏使脂肪合成减少[26]，肝脏脂肪酸的合成基因表达下调。赖氨酸过量也类似地显著降低了肝脏脂肪酸的合成基因ACC、ME、SREBP-1的表达，可能是因为随着赖氨酸的增加，大部分的能量会转化为蛋白质，使得脂肪合成减少[27]。

3.3 脂质代谢相关基因表达与腹脂率的相关分析 本研究表明，日粮赖氨酸缺乏及其导致氨基酸不平衡时，会引起肉鸡生长发育、腹脂沉积显著下降。本研究结果表明，肝脏FABP1基因的mRNA表达与肉鸡的腹部脂肪率显著正相关，这与蒋瑞瑞等[28]的研究结果一致。此外，ACC基因在肝脏中的mRNA表达水平与肝脏ME和SREBP-1基因呈正相关，这与Tang等[29]的研究结果一致。FABP1和ACC都是促进脂肪合成的关键基因。本试验研究表明，赖氨酸过量时，ME表达量显著下调，腹脂率也减少。Grisoni等[26]研究结果一致，即ME活性与腹脂沉积同步变化。

4 结 论

本研究初步揭示日粮赖氨酸缺乏或过量及其导致的氨基酸不平衡主要是通过下调肝脏脂质合成代谢相关基因的表达，而降低肉鸡的生长发育及脂肪沉积。