新活络效灵丹对ApoE基因敲除早期动脉粥样硬化小鼠Cav-1、SR-BI的影响❋

耿 涛，房玉涛，张 云，刘桂芳

(中国中医科学院广安门医院，北京 100053)

胆固醇逆向转运(reverse cholesterol transport，RCT)是血脂代谢的关键环节，其能力的强弱决定着动脉粥样硬化的进程与转归。B族I型清道夫受体(B scavenger receptor family of type I，SR-BI)、小凹蛋白-1(Caveolin-1，Cav-1)作为重要的脂质转运体在RCT起始步骤中起重要作用[1-2]。

本研究通过ApoE基因敲除小鼠AS模型，观察新活络效灵丹对ApoE基因敲除小鼠早期AS的斑块面积和斑块/管腔面积比值(PA/ALA)的影响，并采用PCR技术，检测主动脉内Cav-1 mRNA、SR-BI mRNA 的表达水平，从而探讨其抗AS早期斑块的可能作用机制。

1 材料与方法[3-4]

1.1 实验动物

6～8周龄ApoE基因敲除雄性小鼠(C57BL/6 J)45只，体质量(17～21) g，给予高脂饲料喂养；6～8周龄清洁级C57BL/6 J雄性小鼠10只，体质量(17～21) g，普通饲料喂养。饲养条件为2级，光照时间7∶00～19∶00，相对湿度40%～60%，室温20～24 ℃，均购自北京大学医学部实验动物中心(许可证号SCXK(京)2011-0012)。

1.2 实验药物及制备

新活络效灵丹组成(颗粒剂型)：丹参30 g，制乳香12 g，制没药12 g，三七4 g，由四川新绿色药业科技发展股份有限公司生产，中国中医科学院广安门医院药剂科制备。阿托伐他汀钙片(立普妥)为大连辉瑞制药有限公司提供，20 mg/片(批号031711k)。

1.3 主要仪器和试剂

光学显微镜(BX-41型，日本OLYMPUS公司)；切片机(日本SAKURA，型号CRM-440)；7900HT型荧光定量PCR仪(购自美国应用生物公司)；Trizol试剂(批号14105，购自Invitrogen公司)；Fermentas K1622 RT逆转录试剂盒(批号00044977,购自MBI公司)；SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(批号1108401,购自美国应用生物公司)；引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。

引物序列：SR-B1,上游引物5’- ACCTTCAATGACAACGACACC-3’，下游引物5’-VVAVAGGATCTCACCAACTGT-3’，扩增物长度234 bp；Cav-1，上游引物5’- TCTACAAGCCCAACAACAAGG-3’，下游引物5’-GACAACAAGCGGTAAAACCAA-3’，扩增物长度241 bp。图像分析软件Image-Pro Plus Version 5.0 (Ipp5.0)。

1.4 方法

1.4.1 动物分组及造模 适应性喂养4 d，然后采用随机数字表法将45只ApoE基因敲除小鼠分为模型组、西药组、中药组各15只，3组均喂以高脂饲料(78.85%基础饲料+0.15%胆固醇+21%脂肪混合而成)13周。另设C57BL/6 J小鼠 10只为空白对照组，给予普通饲料喂养。

1.4.2 各组小鼠给药方法 根据成人临床推荐的常用剂量，按成人与小鼠的体质量折算系数10折算成小鼠用量，造模同时即给予药物干预，中药组饲以新活络效灵丹颗粒剂9.67 g/(kg·d)灌胃，西药组饲以阿托伐他汀钙片3.33 mg/(kg·d)。中药组和西药组药物均以蒸馏水溶解后按体质量比灌胃，模型组按体质量比以生理盐水灌胃，连续给药13周，空白对照组小鼠则不予以处理。

1.5 观察指标与方法

取材前夜禁食水。处死全部小鼠，无菌条件下取出主动脉根部。(1)部分组织常规石蜡包埋切片，自主动脉根部连心肌部分横断面进行连续切片(厚度5um)[5]。对切片进行HE染色，倒置显微镜下观察主动脉横切面组织学改变、AS病变程度，×15倍镜下应用IPP5.0图像分析软件测量各组ApoE基因敲除小鼠内弹力膜围绕面积(internal elastic laminal area IELA，μm2)、动脉管腔面积(artery lumen area，ALA, μm2)，计算斑块面积、斑块/管腔面积比值[6]。公式如下[2]：斑块面积(plaque aera，PA，μm2)=IELA-ALA，斑块/管腔面积比=PA/ALA。(2) 部分组织置于冻存管内液氮骤冷保存。采用RT-PCR 法检测小鼠主动脉中SR-BImRNA、Cav-1mRNA表达，具体步骤参照试剂盒说明进行操作。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 各组小鼠主动脉组织HE染色结果

图1显示，空白对照组(A):主动脉内膜光滑连续，内皮细胞排列均匀，表面光滑，未见泡沫细胞及炎性细胞；模型组(B)：主动脉内形成明显的AS斑块，并可出现脂质核心，胆固醇和胆固醇酯沉积，泡沫细胞增多，大量的巨噬细胞浸润；西药组(C)：管壁可见AS斑块，斑块面积明显小于模型组；中药组组(D)：斑块面积显著减少，部分内膜较为光滑。

图1 各组小鼠主动脉根部组织病理比较(HE染色×15)注：图1B.模型组小鼠主动脉根部组织病理图，箭头所指为AS斑块，且出现明显脂质核心，周围大量巨噬细胞的浸润；图1 C为西药组小鼠主动脉根部组织病理图中箭头所指同样为 AS斑块，但斑块面积明显小于模型组

2.2 各组小鼠主动脉斑块面积、斑块/管腔面积比值(PA/ALA)结果及主动脉Cav-1 mRNA、SR-BI mRNA表达比较

表1显示，IPP5.0图像分析软件测量计算各组ApoE基因敲除小鼠主动脉切片的斑块面积及PA/ALA后，结果显示空白组主动脉内膜光滑连续，未见斑块。模型组斑块面积明显增大，与模型组比较，西药组斑块面积显著缩小(P<0.01), PA/ALA显著降低(P<0.01)；中药组与模型组比较，斑块面积、PA/ALA均有显著改变(P<0.01)；西药组与中药组比较，斑块面积、PA/ALA差异无统计学意义(P>0.05)。模型组小鼠主动脉组织中SR-BI mRNA、Cav-1 mRNA表达水平低于空白组(P<0.05)；西药组小鼠主动脉组织中SR-BI mRNA、Cav-1 mRNA表达水平高于模型组 (P<0.05)；中药组小鼠主动脉组织中SR-BI mRNA、Cav-1 mRNA表达水平明显高于模型组(P<0.01)；中药组SR-BI mRNA表达水平高于西药组，西药组Cav-1 mRNA表达水平高于中药组，但2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 新活络效灵丹对各组小鼠斑块面积、斑块/管腔面积比值(PA/ALA)的影响及各组小鼠主动脉组织中Cav-1 mRNA、SR-BI mRNA表达比较

注：与空白对照组比较：*P<0.05；与模型组比较:△P<0.05，△△P<0.01

3 讨论

AS是心脑血管疾病的主要致病基础，具有进展性和全身性的特点,也是一个稳定期与不稳定期交替的过程[7]。防治AS的关键在于能否进行早期干预，延缓斑块形成和稳定斑块。到目前为止，他汀是AS药物治疗的基石,但其肝功能受损、肌毒性、糖尿病风险增加、老年人记忆力减低等问题无法回避[8-12]。近年来，胆固醇逆向转运逐渐成为抗动脉粥样硬化的研究热点，其初始过程是以通过Cav-1、SR-BI等多种蛋白参与，使细胞内胆固醇外流，从而有利于机体排出多余的胆固醇[13]。因此，药物干预RCT对于AS的治疗具有重要意义。

小凹(Caveolae) 是细胞膜上存在的一种特异性凹陷结构，直径50～100 nm，是细胞内胆固醇的主要流出部位，在调节细胞内胆固醇以及维持细胞内胆固醇的动态平衡方面有重要影响[14]。小凹蛋白(Caveolin)是构成小凹的标志性核心蛋白，Cav-1是小凹蛋白中分布最为广泛、高亲和力的脂质结合蛋白，是形成细胞膜Caveolae结构的主要分子基础[15]。其通过激活蛋白激酶信号通路促进血管新生，改善局部缺血情况[16-17]。最新研究证实，Cav-1对动脉粥样硬化具有抑制作用，不仅体现在对平滑肌细胞增殖、转移的抑制、巨噬细胞凋亡的诱导、凋亡细胞的清除之外，还与降低炎症反应、稳定斑块紧密相关[18]。脂质能增强炎症反应，而炎症又促进脂质沉积，二者相互影响加速AS的发生和发展。Cav-1能调节炎症细胞和内皮细胞中信号传导通路，进而影响炎症反应过程[19-20]。既往研究表明，小凹及小凹蛋白1是胆固醇逆向转运和炎症应答的共同分子平台，在调节细胞内胆固醇的动态平衡方面起重要作用[21-22]。

B型I类SR(SR-BI)属于CD超家族，是一种CD36相关蛋白。1996年Acton等首次证实，SR-BI为可选择性介导胆固醇吸收的高密度脂蛋白(high density lipoproteins，HDL)受体[23]，能介导胆固醇和胆固醇酯自HDL颗粒的转运，并与HDL一起对于动脉粥样硬化性心血管疾病的发生起保护作用[24-25]。通过SR-BI基因敲除大鼠的实验，验证了SR-BI在胆固醇的选择性吸收、运输及控制血浆胆固醇水平中的决定性作用[26]。

活血化瘀中药防治AS的临床疗效已得到确认[27]，但不同种类的活血化瘀药在抗AS中作用靶点有何不同，在各个阶段中有何各自特点和优势，尚缺乏深入研究。故挖掘简便效廉、机理明确、早期干预作用突出的抗AS活血化瘀方剂，有着非常重要的现实意义。

活络效灵丹(制乳香、制没药、当归、丹参)出自张锡纯所著《医学衷中参西录》。近年，此方对动脉粥样硬化与心脑血管疾病的治疗作用日益受到关注[28]。树脂类活血化瘀中药乳香、没药均能宣通气血、透达脏腑经络，现代研究表明，乳香具有抗氧化、抗炎、降脂等药理活性，其抗炎作用与对炎症细胞因子的调控和对蛋白激酶通路的影响有关[29-30]。没药其活性成分能降低炎症介质过氧化物酶的活性[31]，具有强效抑制急慢性炎症的作用。新方以三七易当归活血益气，制约乳香、没药久服耗气之弊，从而达到养血不留瘀、祛瘀不伤正的目的。现代研究表明，三七有效组分三七总皂苷在提高心肌对缺氧环境耐受力的同时，还具有扩张血管、改善血供、增强免疫[32]的作用。丹参具有活血祛瘀、养血安神之功，现代研究表明，丹参可抗血小板聚集、降低血液黏稠度、改善微循环、扩张冠状动脉、持续降低心肌耗氧、防止心肌缺血和心梗的发生，其有效组分丹参酮可降低炎症细胞活性，抑制炎症因子和趋化因子表达，抗氧自由基损害，降低缺血组织的再灌注损伤[33]。4药配伍具有活血化瘀、益气通络之功，临床治疗动脉粥样硬化疗效显著，但具体作用机制尚需进一步阐明。

本研究结果显示，与模型组比较，中药组和阿托伐他汀钙组动脉粥样硬化斑块面积明显缩小，2组均具有延缓动脉粥样硬化早期斑块形成的作用。中药组动脉粥样硬化小鼠主动脉组织Cav-1 mRNA、SR-BI mRNA表达提示明显升高，与模型组比较差异明显，提示新活络效灵丹具有提高动脉粥样硬化小鼠主动脉组织Cav-1 mRNA、SR-BI m RNA的表达作用，从而提高细胞内胆固醇流出的能力，推测为防治AS早期斑块形成的机制之一。